HPLC法测定果蔬中维生素C含量

孙 晶，张晓莉，师敬敬，郭婷婷

（河南广电计量检测有限公司，河南郑州 450000）

维生素C又名抗坏血酸（Ascorbic Acid），对人体的生长发育十分重要，能促进代谢及合成胶原蛋白，还能保护细胞膜不受损害，有解毒功效，能有效减少患癌的风险[1-2]。在实际的疾病治疗上，常被作为辅助药物治疗糖尿病和甲状腺机能亢进[3]。在人体内，维生素C是高效的抗氧化剂，可减轻抗坏血酸过氧化物酶的氧化应激，参与体内多种重要的生物合成。由于自身不能合成，人们往往从食物中获取维生素C，因此研究果蔬中维生素C的含量有重要意义。

目前维生素C的常用检测方法有高效液相色谱法、紫外分光光度法、2,6-二氯靛酚钠盐滴定法、钼蓝比色法等[4]，其中高效液相色谱法具有分离效率高，稳定性好，高灵敏度等优点，广泛应用于食品药品中各类维生素的检测[5]。GB 5009.86—2016将样品中维生素C用偏磷酸溶液超声提取后，以离子对试剂为流动相，利用HPLC法测定。由于偏磷酸有剧毒，离子对试剂的使用降低了柱子的耐用性。为解决此问题，本文采用2%乙酸溶液代替偏磷酸溶液为提取液，以甲醇-0.2%乙酸溶液（2∶98，V/V）为流动相，有效解决了该问题。本实验建立了一种精确、简单、快速测定果蔬中维生素C含量的方法，为果蔬中维生素C的测定提供了参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

本实验中水果和蔬菜均采购于超市。

1.2 仪器与试剂

赛默飞U3000高效液相色谱仪，配有二极管阵列检测器；色谱柱：C18柱（5 μm，4.6 mm×250 mm），超声波清洗器；L(＋)-抗坏血酸，D(-)-抗坏血酸，BePure公司；实验所用水均为超纯水，其他试剂均为分析纯。

1.3 色谱测定条件

色谱柱：C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相0.2%乙酸：甲醇（98∶2），检测波长：245 nm，流速：1.0 mL/min，柱温：25 ℃。进样量20 μL，在上述色谱条件下，L(＋)-抗坏血酸的保留时间约为4.243 min，D(-)-抗坏血酸的保留时间约为4.430 min。分离度良好，且峰型佳。

1.4 维生素C标准储备液配制

准确称取对照品L(＋)-抗坏血酸，D(-)-抗坏血酸5.0 mg，用2%乙酸溶液溶解L(＋)-抗坏血酸和D(-)-抗坏血酸，定容至10 mL的棕色容量瓶中，其浓度为0.5 mg/mL，现用现配。标线采用0.2%乙酸进行配制，线性范围为0.1 ～ 10 μg/mL。

1.5 样品的制备

称取2.0 g果蔬样品至50 mL棕色容量瓶中，加入20 mL 2%乙酸溶液提取，超声冰浴提取15 min后，4 000 r/min离心3 min，转移至另一50 mL棕色容量瓶中，下层残渣中再加入20 mL 2%乙酸溶液重复提取，转移入同一容量瓶中定容至刻度，经0.22 μm微孔滤膜（尼龙）过滤后，经HPLC分析。样品含量超线性时稀释至标线范围内上机。标准溶液和样品中抗坏血酸的色谱图分别见图1和图2。

图1 维生素C标准品色谱峰

图2 样品中维生素C色谱峰

2 结果与分析

2.1 色谱条件的选择

监视了245 nm和254 nm两种波长下的L(＋)-抗坏血酸和D(-)-抗坏血酸的响应，结果发现在两种波长下的响应差异不明显，且GB 5009.86—2016中抗坏血酸的检测波长为245 nm，故最终选择245 nm作为抗坏血酸的检测波长。样品的检测时间在8 min后没有杂质峰，基线趋于平稳，故选择检测时间为8 min。

2.2 L(＋)-抗坏血酸和D(-)-抗坏血酸的线性

测 定 了 浓 度 为 0.1 μg/mL、0.2 μg/mL、0.5 μg/mL、1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、5.0 μg/mL 和 10.0 μg/mL 时L(＋ )-抗坏血酸和D(-)-抗坏血酸的响应，结果表明在线性范围0.1～10 μg/mL范围内L(＋)-抗坏血酸和D(-)-抗坏血酸的线性关良好。相关系数均在0.999以上，见图3和图4。

图3 L(＋)-抗坏血酸线性

图4 D(-)-抗坏血酸线性

2.3 提取溶液的选择

分别选择0.2%、2.0%、5.0%的乙酸作为提取液，经过比较发现，选用0.2%的乙酸溶液作为提取液时，样品的基质峰出峰时间过长，目标峰在基质峰曲线上，基线不平，如图5所示。选用5.0%的乙酸溶液作为提取液与2.0%的乙酸溶液作为提取液时的样品的响应相差不大，峰型接近，但是5.0%乙酸的酸性相对较大，考虑到柱子的酸碱耐受性，最终选择2.0%的乙酸作为提取液。

图5 0.2%乙酸提取时样品中L(＋)-抗坏血酸

2.4 提取次数的选择

分别对11类果蔬样品进行了3次提取并测定抗坏血酸的含量。结果表明，一次提取的值相对较低，二次提取与3次提取的值相差不大，如图6所示。由于抗坏血酸易分解，故长时间的前处理也不易于实验的准确性，所以选择两次提取做为该实验的最佳提取次数。

图6 不同提取次数下11种果蔬中维生素C含量

2.5 样品中维生素C的含量

经过试验，测定出的11种果蔬中的维生素C的含量如图7所示。

图7 11种果蔬中L(+)-抗坏血酸的含量

由图7可知，西红柿、豌豆芽、菠菜、胡萝卜、辣椒、黄瓜、西瓜、脐橙、皇帝柑、砂糖橘和红心蜜柚中L(+)-抗坏血酸的含量分别为10.9 mg/100 g、9.77 mg/100 g、73.3 mg/100 g、1.68 mg/100 g、3.08 mg/100 g、6.37 mg/100 g、8.25 mg/100 g、43.4 mg/100 g、23.4 mg/100 g、16.3 mg/100 g和29.4 mg/100 g。

2.6 加标回收实验L(＋)-抗坏血酸的含量

分别选择了西红柿、胡萝卜、西瓜进行了加标实验，加标量分别为 1 μg/mL、2 μg/mL 和 5 μg/mL。L(＋ )- 抗坏血酸和D(-)-抗坏血酸的回收率如表1所示。如表1所示，在不同的添加水平下L(＋)-抗坏血酸和D(＋)-抗坏血酸的回收率均在90%以上，且不同类别的果蔬产品中所含的抗坏血酸均为L(＋)-抗坏血酸，因为D(-)-抗坏血酸的稳定性不强，特别容易分解。西红柿中的L(＋)-抗坏血酸回收率在98.0%～103.0%，胡萝卜中的抗坏血酸L(＋)-抗坏血酸回收率在91.7%～98.3%，西瓜中L(＋)-抗坏血酸回收率在99.2%～101.0%，D(-)-抗坏血酸的回收率均在98%以上。

表1 西红柿、胡萝卜、西瓜中L(＋)-抗坏血酸和D(-)-抗坏血酸回收率

3 结论

维生素C属于见光易分解的物质，所以在配制标线以及样品处理过程中用到是棕色容量瓶和进样瓶，标准溶液配置需在准备上机前再进行配制；醋酸的浓度越高其处理后样品的色谱峰越干净，所以酸度对峰型、分离度等有一定的影响。本方法采用高效液相色谱－紫外检测器法对果蔬中的维生素C含量进行分析，确定了果蔬中维生素C的测定方法为样品经过2%乙酸提取两次后经HPLC测定，检测波长为245 nm，流动相比例为0.2%的乙酸∶甲醇（98∶2）。该方法回收率高，检测方法方便快捷。