乳清蛋白及与其它乳成分的热聚合作用机制研究进展

陈 笛 王存芳

（齐鲁工业大学（山东省科学院）食品科学与工程学院 济南250353）

热处理是乳品加工不可或缺的一步，乳蛋白质是乳品的核心组分，乳清蛋白是全价蛋白，有“蛋白之王”的美誉，是食品产业中较理想的蛋白补充剂[1]。乳清蛋白不仅具有极高的营养价值，还有起泡、涂层、乳化、成胶性及微胶束化等突出功能特性[2]。原料乳经热处理时，使原本呈卷曲结构的蛋白质展开，进而导致疏水基团外露，此过程中乳清蛋白与乳成分中的酪蛋白、乳脂球膜蛋白、乳糖、盐及乳脂发生相互作用。该反应不仅影响产品的微观结构，而且对产品的流变性、功能特性、持水性等宏观表现产生较大的影响[3]。本文针对不同热处理温度下乳清蛋白的热变性聚集过程，阐述乳清蛋白与其它乳成分的热聚合作用机制，有助于调控乳成分间的相互作用，进而调控乳品的热稳定、凝胶性、持水性等功能特性，这对于乳品资源的有效利用和加工开发相关产品都有一定的理论意义。

1 乳清蛋白的热聚合作用

1.1 乳清蛋白的组成

乳清蛋白含有β-乳球蛋白 （β-Lactoglobulin,β-Lg）、α-乳白蛋白（α-Lactalbumin，α-La）、免疫球蛋白、糖巨肽（Glycomacropeptide，GMP）、血清白蛋白（Serum albumin，SA）、乳铁蛋白（lactoferrin，LF）、乳过氧化物酶（Lactoperoxidase，LP）和一些小分子成分。不同乳源含量有所差异，牛乳和羊乳乳清蛋白各组分的含量、结构与功能见表1[4～5]。

1.2 乳清蛋白间的热聚合作用机制

β-Lg 是乳清蛋白中含量最高且极易受温度影响的一类蛋白，其在半胱氨酸残基的66～160，119 与106 或121 位点形成两个二硫键 （见图1a）。α-La 含有的半胱氨酸残基通过位于6～120，28～111，61～77，73～91 间的二硫键链接（见图1b）[6]。

常温下β-Lg 以二聚体形式存在，当加热温度高于30 ℃，β-Lg 二聚体即发生解离，其三级球状结构解体，螺旋结构消失[7]。高于85 ℃时，二硫键断裂，分子内疏水基团暴露，α-螺旋内部含有的半胱氨酸残基暴露，易与其它分子交联成二硫键（见图2～图3）[8]。

与β-Lg 不同，α-La 因不发生二硫键交换反应，在加热温度高于70 ℃，即使有巯基暴露，α-La自身亦不会发生热聚合。但高于80 ℃时，开始变性的α-La 与β-Lg 聚集体结合形成更大的乳清蛋白聚集体[9]（见图4a）。

免疫球蛋白G（Immunoglobulin，IgG）对热极不稳定，只能在65 ℃以下耐受巴氏杀菌，温度高于70 ℃，则Fab 片段中CH 区将会展开，发生非一级反应的热变性，其热变性动力学符合Arrhenius方程[10]。周英爽[11]表明凝胶色谱法发现两个IgG 与1 个LF 结合成复合物。此外，带有正电荷的LF 能与带有负电荷的β-Lg 通过静电作用力形成复合物[12]。通过Zeta 电位仪与纳米粒度扫描仪分析，发现当向LF 体系中不断加入β-Lg 时，其电势逐步由正变到零继而转为负；反方向添加时，则电势逐步由负变正。由此说明，带有相反电荷的两种蛋白通过静电作用结合。在牛乳体系中带有负电荷的血清白蛋白以物质的量比约为1 ∶1 的比例与LF相互作用，如图4b 所示[13]。热处理会改变各个复合物的热力学特性，可通过人为改变温度进而根据需要促进或抑制体系中二者的结合，进而控制LF 与其它成分的解离程度，在工业生产中，更高效的生产LF 相关产品[14]。

表1 乳清蛋白的主要组成组分Table 1 The main component of whey protein

图1 β-Lg（a）、α-La（b）一级结构中含硫氨基酸的分布图[6]Fig.1 β-Lg （a）, α-La （b）primary structure of sulfur-containing amino acid profile

图2 β-Lg 乳球蛋白三级结构及受热结构展开图Fig.2 Tertiary structure of β-lactoglobulin and the unfolded structure under heat treatment

图3 β-Lg 加热变性过程图Fig.3 β-Lg heat denaturation process

图4 乳清蛋白间的热聚合作用Fig.4 Thermal polymerization of whey protein

2 乳清蛋白与其它乳蛋白的热聚合作用

2.1 乳清蛋白与酪蛋白的热聚合作用机制

酪蛋白（Casein，CN）是由β-酪蛋白（β-CN）、αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、κ-酪蛋白 （κ-CN）4 种单体通过组装双嵌组成的复合物。酪蛋白胶束模型以Slattery 和Schmidt[15]提出的亚单元模型最被认可：胶束形成是因亚单元和磷酸钙之间存在疏水作用，κ-CN 位于胶束表面，其余3 种单体均衡分布于整个胶束。本文应用的模型以此为基础。

图5 乳清蛋白与酪蛋白的热聚合作用机制Fig.5 Mechanism of thermal polymerization of whey protein and casein

带有负电荷pI 为4.6 的酪蛋白胶束可结合LF。Anema[16]向乳铁蛋白溶液中滴定CN 且进行反向试验发现，LF 会通过静电作用结合胶束中的CN，且LF 以2∶1 的方式与α-CN 结合，以1 ∶1 的方式与β-CN 结合，以1∶4 的方式与κ-CN 结合，该反应可通过温度控制LF 的解离程度 （图5中上）。CN 的聚合与解离过程均与温度相关，开始升温时，CN 因热碰撞频率增加易结块，在温度高于55 ℃时，蛋白质胶束的次级结构遭到破坏，静电斥力增加反而使CN 不易结合[17]。当温度高于70 ℃，β-CN 与αs-CN 从胶束上解离，胶束表面的κ-CN与β-Lg 以巯基-二硫键的方式进行交换（图6a），进而附着于胶束表面聚合成络合物，影响乳品的热稳定性。75 ℃时，发生半胱氨酸巯基裂解（β-消去）（图6b），使产品产生蒸煮味，恶化乳品风味[18]。且随温度升高，逐步增强的乳蛋白间的疏水作用会进一步促进κ-CN 与β-Lg 的结合，粒子直径会逐步增大。此过程中，游离的κ-CN 亦与乳清蛋白发生结合[19]，如图5所示。高于80 ℃，α-La 与CN结合量增加。当加热温度达到100 ℃时，CN 与乳清蛋白表面的疏水性均明显增加，且前者与后者的比值降低将增大该差异的产生[20]。继续升温，位于酪蛋白胶束内部的疏水基团发生暴露进而增强表面作用力。在温度高于140 ℃，蛋白质发生变性以至胶粒分布范围缩小，但因胶束表面疏水域的存在使胶束直径明显增加[21]。

图6 高温下蛋白质侧链残基发生的巯基-二硫键交换（a）和半胱氨酸巯基裂解反应（b）图Fig.6 Sulfhydryl-disulfide exchange （a）and cysteine thiol cleavage （b）at the protein side-chain residues at high temperature

乳清蛋白与CN 的热聚合作用对酸奶品质有重要影响，乳清蛋白可作为酸奶的增稠剂，提高酸奶的蛋白含量、持水力与网络结构。变性的乳清蛋白含有较少的游离巯基，有利于酸奶发酵菌落的生长[22]。当温度不高时，α-La 几乎不发生变性，只有变性的β-Lg 与CN 结合，表面疏水性很高且会出现沟纹。增加加热强度，变性的α-La 将覆盖β-Lg 附属丝状物，蛋白持水性增加，使表面疏水性降低且呈现光滑状态[23]。而且，乳蛋白之间相互结合形成热变性乳蛋白聚合物，乳清蛋白聚集形成强度较大的凝胶，进而起到强化凝胶交联网络结构的作用（图7中Ⅰ～Ⅲ）[24]。制作酸奶时，能够较快凝乳且较少的析出乳清，很好地改善凝胶的流变学特性。因此，热变性的乳清蛋白与酸奶的凝胶特性与黏度密切相关，且变性度约95%才能保证酸奶品质[25]。此外，提高乳清蛋白与CN 的比例，能增加酸奶的持水性、黏度和硬度，亦能使网络结构变得更加紧密与均匀，使口感更加润滑与细腻，且减少乳清析出（图7中ⅰ～ⅱ）[26]。可根据温度对酸奶的影响，控制乳清蛋白与CN 比例得到高品质酸奶。

图7 原料乳经热处理后的直观变化图Fig.7 Raw milk after heat treatment changes in the visual

2.2 乳清蛋白与乳脂球膜蛋白的热聚合作用机制

热处理能明显改变乳脂球膜 （milk fat globule membrane，MFGM）蛋白组的表达，其组分如乳凝集素、鸟嘌呤核苷酸、溶解酵素和抗菌肽Ⅰ的含量均随温度升高而降低。

温度为60 ℃时，MFGM 蛋白含有的半胱氨酸残基会生成硫化氢，开始变性的氧化酶（XO）与嗜乳脂蛋白 （butyrophilin，BTN）因二硫键固定到MFGM 蛋白上[27]。何胜华[28]发现热处理对牦牛MFGM 蛋白的组成有影响，温度高于40 ℃，脂质相熔点会使乳脂肪球表面改变，导致过碘酸稀夫6/7（PAS6/7）开始迁移进入乳清。且在60 ℃处理15 min，因β-Lg 与MFGM 蛋白的结合改变了膜结构，使得PAS6/7 的含量明显降低。温度高于70℃，β-Lg 和α-La 分别以1 个巯基、2 个二硫键和1 个巯基、8 个二硫键与MFGM 蛋白进行结合，但随温度提高以及加热时间增长，结合方式会有所改变（图8右下）[29]。

图8 酪蛋白和乳脂球膜蛋白间的相互作用Fig.8 Interaction between casein and milk fat globule membrane proteins

3 乳清蛋白与乳糖的热聚合作用机制

乳糖是乳中天然存在的双糖。α-La 与UDP-半乳糖转移酶具有相近的生理功能，其能改变酶的专一性，使半乳糖转为葡萄糖，因此，其与乳糖的合成密切相关[30]。即使是室温贮存，β-Lg 的ε-氨基亦会与乳糖醛基以共价键的形式进行缩合，即糖基化反应（美拉德反应开始）。该反应初期阶段生成薛夫碱，经环化及不可逆的Amadori 重排，生成稳定的产物，具体反应见图9～图10[31～32]。

β-Lg 与α-La 存在多个糖基化位点，且Lys47、Lys91 和Lys100 位点较为活跃，因此，乳糖易亲和游离赖氨酸残基，进而导致β-Lg 的三级结构易受热展开[33]。随着糖基化进一步反应及Strecker分解，美拉德反应产生的丙二醛和乙二醛会结合精氨酸与赖氨酸，最终导致蛋白交联。此过程中，乳糖转化为乳果糖（Lactulose），然后生成包含5-羟甲基糠醛（HMF）的多种化合物，最终转变为类黑精类物质。即乳粉发生褐变且极易结块变硬，且温度高于100 ℃现象极其明显（见图7中A1～C2）[34]。但褐变可应用于改善焙烤食品的色泽与品质。Kennedy[35]早已利用乳糖和变性乳清蛋白的冷凝胶特性作为壁材制备微胶囊。此外，宋春丽[36]发现，β-Lg 主要以氢键结合乳糖，β-Lg 与乳糖在60 ℃混合加热时，能提高所得糖蛋白的溶解性、乳化性以及热稳定性。

图9 美拉德反应初期Fig.9 Maillard reaction first step

图10 β-Lg/乳糖糖基化反应Fig.10 β-Lg / lactose glycosylation reaction

4 乳清蛋白与钙盐的热聚合作用机制

α-La 是钙金属蛋白质，其含有的4 个天冬氨酸结合一个Ca2+，Ca2+有利于蛋白质的折叠，结合Ca2+的α-La 热稳定性较好，且在较低温度下可以复性[37]。但温度升高，蛋白结构被改变，Ca2+将提高β-Lg 与α-La 的热变性敏感度。通过ζ-电位发现乳清蛋白质中的羧基与磷酸钙中带有正电荷的C-位点通过静电、配位和螯合键结合，而氨基通过静电作用与带负电的P-位点进行作用；碳酸钙与乳清蛋白中的氨基通过电荷富集方式进行相互作用，乳清蛋白质中的羧基与Ca2+结合成羧酸钙[38]，如图11所示。加热强度会影响静电作用力进而影响钙盐的平衡。温度高于65 ℃时，乳清蛋白结构展开，活性氨基酸暴露，增强乳清蛋白间的疏水作用。而乳清蛋白与Ca2+结合产生钙-蛋白复合物，会减少分子间的静电斥力（钙离子效应），使得静电排斥力小于疏水作用，最终导致溶液产生热沉淀，对乳体系的热稳定性产生较大影响（见图7，1～4）[39]。

图11 磷酸钙、碳酸钙对乳清蛋白的吸附机理模型Fig.11 Adsorption mechanism model of calcium phosphate and calcium carbonate for whey protein

5 乳清蛋白与乳脂的相互作用机制

乳脂肪主要由甘油三酯组成，对乳品风味有重要作用，牛乳脂肪的熔点为-30 ℃～40 ℃。热处理温度高于60 ℃，乳脂将出现游离巯基[40]。达到70 ℃时会导致脂肪球膜蛋白变性，氨基酸残基暴露从而打破稳定的复合脂肪球膜，然后脂肪球以二硫键与变性的乳清蛋白发生聚集，进而增大脂肪球直径，聚集程度与温度成正比[41]。高于100℃，乳脂肪结构会因乳清蛋白的结合发生改变，且温度低于125 ℃时，脂肪球直径仍随温度升高而增加。但在温度高于135 ℃时，脂肪球会因脂肪球膜的破裂而发生破碎，进而降低脂肪球直径以及完整状态的脂肪球数量，此时，会产生游离脂肪酸出现析油等现象，最终导致劣质的乳制品[42]。对超高温乳而言，与脂解相关的脂肪酶是存在于乳清与脂类界面上唯一有活性的酶，其热稳定性较高，会导致乳品变质。此外，加热会导致脂肪氧化并与MFGM 蛋白发生作用进而产生特殊的风味，对乳粉、酸奶、乳酸菌饮料等乳制品的口味产生影响[43]。

6 展望

乳清蛋白尤其是β-Lg、LF 与α-La 被广泛应用于各个产业，随着科学技术的不断进步，乳清蛋白的潜在市场空间巨大[44]。黄顺丽[45]通过分离纯化方法制备乳清蛋白钙螯合肽作为补钙剂。国外有学者针对术后病人研究相应的乳清蛋白产品[46]。原料乳经热处理时，乳清蛋白尤其是热不稳定的β-Lg 结构将会发生变化，此时，不仅自身发生凝集，亦会与其它乳成分如酪蛋白、乳脂球膜蛋白、乳糖、钙盐，乳脂发生结合，进而改变产品特性[47]。制作干酪时，应尽可能排除乳清；而制备酸奶时，应尽力防止乳清析出；生产乳粉时，应保持乳粉原本的颜色；而加工面包时，应利用美拉德反应使面包呈现金黄色，我们应根据不同产品，选择相应的热处理方式。因此，合适的热处理方式是保证高品质乳制品的重要加工环节。随着蛋白质组学等相关研究的逐步深入，乳清蛋白质的相关研究虽有突破但仍有不足，不同乳源其蛋白质组成有所差异，其作用途径也不尽相同，仍需学者继续研究完善。探讨热加工过程中乳清蛋白质的相关变化，分析乳蛋白质间以及乳清蛋白质与其它乳成分的相互作用，并对其进行控制以提高乳品的热稳定性和凝胶性、乳化性、起泡性等功能特性，最后应用于工业化生产，使乳体系向着人们所需的方向进行调整，为生产符合需要的乳制品奠定理论基础。