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类蛋白反应修饰的牡蛎肽锌结合物的生物利用性

2020-04-03王再扬曹玉惠赵元晖崔永日薛长湖曾名湧

中国食品学报 2020年3期
关键词:补锌缺锌多肽

王再扬 曹玉惠 赵元晖* 崔永日 薛长湖 曾名湧

(1 中国海洋大学食品科学与工程学院 山东青岛266003 2 青岛康迈臣生物科技有限责任公司 山东青岛266105)

牡蛎是世界第一大养殖贝类,也是我国四大养殖贝类之首。据2016年中国渔业年鉴统计数据显示,2015年我国牡蛎产量为457 万t[1],占世界总量的75%以上。牡蛎体内蛋白质含量丰富,有“海洋牛奶”之称。酶解牡蛎蛋白制备活性肽是其高值化利用的有效途径之一。针对牡蛎源活性多肽的研究受到研究者的青睐。余杰等[2]研究发现牡蛎活性多肽BPO 能诱导宫颈癌HeLa 细胞的凋亡,实现抗肿瘤的作用。牡蛎还含有丰富的矿质元素,尤其是钙和锌含量,并且牡蛎软体中的氨基酸或多肽能与部分锌形成复合物,进而间接表明牡蛎蛋白酶解液很可能具有较高的锌离子螯合活性。

类蛋白反应是浓缩的蛋白水解物在合适条件下经蛋白酶作用形成凝胶状物质的反应[3-4]。沈晴晴等[5]通过类蛋白反应修饰海地瓜的酶解物,获得一条高活性的ACE 抑制肽。Ono 等[6]应用Acalase催化的类蛋白反应修饰乌贼蛋白水解物,最终提高了该水解物的抗氧化活性。目前多数研究是利用类蛋白反应修饰改善酶解液活性,而未对修饰肽的活性与结构特征的关系进行探究。本项目组早期从牡蛎蛋白酶解产物中得到HLRQEEKEEVTVGSLK 锌结合活性肽[7],其锌结合能力为6.56 mg/g。张娟娟[8]通过在类蛋白反应中添加外源氨基酸Tyr、Pro、Trp、Phe、Leu 等,控制反应条件,制备出具有较高锌结合能力的牡蛎源活性肽(EVPPEEH),其锌结合能力为161 mg/g,是原牡蛎酶解活性肽(HLRQEEKEEVTVGSLK)的25 倍。由此可见,酶法制备锌结合肽的较低结合能力已成为其研究与开发的瓶颈。类蛋白反应在改善多肽功能性和食物蛋白营养性方面显示出巨大的潜力,具有无需添加任何有机溶剂或化学试剂的优点,必将在食品工业中有广泛的应用。

锌是人和动物所需重要的微量元素之一,具有重要生物功能[9]。机体缺锌会导致基础代谢下降,影响生长发育等多方面的负面影响[10]。研究表明有机锌接近于机体内锌的功能作用形式,其生物学利用效率比无机锌高[11]。肽类是近年来广受食品、医药等领域关注的具有生物活性物质。斯开兴等[12]发现带鱼酶解肽亚铁螯合物能显著改善大鼠贫血状况。肽锌复合物相对于传统的补锌产品具有高稳定性、高生物效价和高吸收率,已成为国内外研究的重点[13]。本研究通过构建缺锌型SD 大鼠模型,灌胃不同形式的锌源一段时间,以SD 大鼠体重、血清及各脏器锌含量和小肠转锌蛋白及小肽转运蛋白的表达量来探讨牡蛎源类蛋白反应修饰肽锌结合物的补锌效果和吸收途径。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料与试剂 太平洋牡蛎,青岛齐东路水产市场;多肽M(EVPPEEH),上海淘普科技有限公司合成,纯度99%;胃蛋白酶,丹麦诺维信公司;硫酸锌;谷氨酸,国药集团化学试剂有限公司;Chelax-100 树 脂,美 国BIO-RAD 公 司;ZnT1、PepT1 ELISA 试剂盒,美国 Cloud-Clone Corp 公司;总蛋白定量试剂盒,南京建成生物工程研究所;无特定病原体级雄性SD 大鼠,山东鲁抗医药集团公司;未特别说明,本研究所用的其它试剂均为分析纯以上。

1.2 样品的制备

1.2.1 牡蛎酶解肽制备 取牡蛎软体,洗净,均质,均质液于100 ℃灭酶10 min,调节pH 至2.0,加入1.5% (m/m)的胃蛋白酶于37 ℃反应2.5 h,酶解结束后100 ℃灭酶10 min。pH 调至7.0,于6 000 r/min,4 ℃条件下离心10 min,取上清过0.45 μm的微孔滤膜,收集滤液过chelax-100 交换树脂层析柱脱盐,真空冷冻干燥后得到牡蛎肽。

1.2.2 类蛋白反应修饰肽牡蛎酶解肽的制备 配制质量分数40%的多肽溶液,加入质量分数1.5%的胃蛋白酶、1%的谷氨酸于pH=5.0,T=37 ℃条件下反应1.5 h 后100 ℃灭酶10 min,冷却至室温,真空冷冻干燥得到类蛋白反应修饰的牡蛎肽。

1.2.3 多肽锌结合物的制备 将多肽溶于超纯水配制成5%的多肽溶液,按多肽与锌盐的质量比为3∶1 加入ZnSO4,于pH=6.5,T=37 ℃条件下反应30 min。加入4 倍体积的无水乙醇除去游离的锌离子,真空冷冻干燥即得肽锌复合物。

1.2.4 锌含量测定 锌螯合活性测定参照文献[14]中的方法并做适当修改。多肽与锌盐反应后参照文献[3]的方法,加入4 倍体积的无水乙醇除去游离的锌离子,将沉淀真空冷冻干燥后采用火焰原子吸收法测定其中锌离子含量,另外采用Folin-酚法测定多肽含量。

1.3 动物试验

1.3.1 动物分组 取60 只雄性的SD 大鼠(体重100~120 g)经1 d 的适应后,将60 只大鼠随机分为6 组,每组10 只。PF 组为正常组,其余5 组为试验组。

1.3.2 缺锌造模 除PF 组外,其余5 组均饲喂低锌饲料和去离子水,饲喂期为4 周。无外源锌添加的AIN-93G 模型饲料(锌含量低于1 mg/kg)和正常饲料(锌含量38 mg/kg)均由饲料生产商南通特洛菲饲料科技有限公司提供。

1.3.3 给药 缺锌模型构建成功后,根据课题组前期研究结果,按照714 μg/(kg·d)(WZn/WRat)的灌胃剂量对试验组进行灌胃处理。ZD 组继续饲喂低锌饲料且同时灌胃生理盐水,ZS 组灌胃硫酸锌(阳性对照组),OPZ 组灌胃牡蛎酶解肽锌结合物,LPZ 组灌胃类蛋白反应修饰的牡蛎酶解肽锌结合物,MZ 组灌胃纯肽锌结合物,这一阶段的饲喂周期为2 周。饲养期一旦结束,待大鼠空腹24 h 后乙醚麻醉处死后,取得所需的组织器官。

1.3.4 指标测定

全诗想象奇特,虽是题画之作,却出入于画面之外。首二句用夸张之语营造一种雄阔之势,三、四句由整体转向局部,描绘出峰头秃树万笏朝天之势。中间六句通过箕山老人前后气色的转变再次凸显蓬莱峰的雄壮气势。接下来两句用“忽然”一词将观者的视线由峰顶引至海边平地。整幅画面,有万仞之高的险峰,有平如江海般的平地。一高一低,一险一缓,给人以强烈的视觉冲击。后四句由画阐发自我感悟,青峰、明月何须购买,本属万物。最后两句化用苏轼“我携此石归,袖中有东海”之句,与首句呼应。

1.3.4.1 大鼠体重、毛色和精神状态 饲喂期间每天对大鼠进行表观现象观察包括毛色、皮肤、饲料摄入情况等等。并从灌胃开始,每天对它们的体重和食量进行称量和记录。

1.3.4.2 血液指标测定 将大鼠麻醉后腹主动脉取血5 mL,低温静置30 min 后,离心(3 500 r/min,10 min,4 ℃)取血清,置原子吸收分光光度仪测定血清中锌含量。

1.3.4.3 各组织中锌含量 大鼠处死后取其肝脏、肾脏、脾脏及股骨,分别用生理盐水洗去血渍,置于90 ℃烘箱烘干至恒重,准确称取烘干样品1.0 g (0.5~1.5 g)于玻璃消解管中,加入15 mL 消化液(高氯酸∶浓硝酸=1∶3,V/V),放置在电热消解仪上进行程序消化。经消解后样品用超纯水定容至10 mL 待测,稀释至合适浓度,用原子吸收分光光度计测得准确锌含量。

1.3.4.4 大鼠小肠ZnT1 和PepT1 蛋白表达水平测定 大鼠处死后取其十二指肠和空肠,用生理盐水及PBS 缓冲液冲洗干净后于-80 ℃保存备用。采用双抗夹心法测定锌转运体和小肽转运蛋白含量。步骤严格依照ELISA 试剂盒附带的说明书进行操作,最后于450 nm 用酶标仪测定底物与酶发生反应的光密度值。小肠样品总蛋白含量用总蛋白定量试剂盒进行测定。

1.3.5 数据处理 数据以平均值±标准偏差来表示。采用最小显著差异法,在SPSS 19.0 统计软件中比较、分析均值的差异性,显著性水平为5%。

2 结果与讨论

2.1 缺锌造模阶段SD 大鼠外观变化

缺锌模型构建期间大鼠的外观变化主要集中在眼睑、爪子及毛发等部位。缺锌组大鼠现出了稀便、啃毛、毛发稀疏、饲料浪费严重,个别大鼠出现眼睑粘连及鼻孔出血的症状,体型瘦弱,体重和摄食量增加缓慢。正常组大鼠眼睑表现出红色,食欲旺盛,体重和摄食量持续增加,活动量明显增加。模型组和正常组在外观表现上差别非常明显。

2.2 肽锌结合物MZ 对大鼠生长的影响

由图1可知缺锌使大体重增长严重受限,缺锌组大鼠两周体重增重率仅为2%,进行补锌后MZ 组、LPZ 组、OPZ 组的大鼠体重增重率分别为72%,71%和66%显著高于ZS 组(P<0.05)。4 种补锌组摄食量相对于缺锌组也显著增加。说明4 种补锌方式均能显著促进大鼠生长改善前期的营养不良状态,且MZ 的促进效果要高于无机锌组。Mingyan Jing 等[15]的研究发现锌缺乏大鼠生长缓慢,可能与缺锌导致其摄食量减少相关,这与本研究的结果相似。Ao 等[16]研究发现给雏鸡饲喂含硫酸锌和蛋白锌的饲料后体重增加并无显著性差异。大鼠体内锌含量供应充足时,缺锌对大鼠生长的抑制作用将被抵消,这也解释了不同锌源对大鼠生长的促进作用有相似的结果。

图1 不同组别大鼠灌胃前后体重和摄食量变化情况Fig.1 Changes of body weight and food intake before and after gavage in different groups of rats

2.3 肽锌结合物MZ 对大鼠血清锌含量的影响

血清锌是评价动物锌营养状况最普遍采用的指标,它能在一定程度上反映不同锌源的生物利用性。由图2可知缺锌组大鼠血液锌含量显著低于补锌组(P<0.05)且进行补锌恢复后,大鼠血清锌含量呈恢复趋势。MZ 组血清锌分别恢复到(0.72±0.24)μg/mL、显著高于LPZ 组、OPZ 组和ZS 组(P<0.05)。其次LPZ 组显著高于OPZ 组和ZS 组。赵洪雷、杨杰等[17]的研究结果显示小肽锌可以显著提高昆明小鼠血清锌含量,其补锌效果优于同剂量的葡萄糖酸锌或硫酸锌。且经过类蛋白反应修饰的牡蛎肽锌结合物对于改善血清锌含量的效果更好。

2.4 肽锌结合物MZ 对大鼠股骨锌含量的影响

大鼠生长的过程中伴随着骨骼的发育,缺锌会使大鼠骨骼中沉积的锌含量降低[18],由图3可知缺锌组大鼠骨骼锌含量要明显低于其补锌组(P<0.05)。进行补锌后3 种肽锌结合物组大鼠股骨锌含量显著高于ZS 组(P<0.05),这与陈达等[7]的研究结果相似,即牡蛎肽-锌结合物的补锌效果优于无机锌。MZ 组骨骼锌含量最高,其次是LPZ组,二者均显著高于OPZ 组和ZS 组(P<0.05),其中MZ 组恢复到约PF 组的一半水平。说明MZ 大鼠缺锌之后股骨锌的消耗量低于各对照组,即MZ在大鼠体内的利用率更高。

图2 不同组别大鼠血清锌含量Fig.2 Serum zinc content in different groups of rats

图3 不同组别大鼠股骨锌含量Fig.3 Femur zinc content in different groups of rats

2.5 肽锌结合物MZ 对大鼠各脏器锌含量的影响

肝脏、肾脏及脾脏是锌代谢的主要器官,研究表明机体处于锌摄入量低时,肝脏、肾脏等脏器中锌的流失量相对较多。由图4可知MZ 组肝脏锌含量和肾脏锌含量均显著高于各对照组 (P<0.05),比无机锌组高出28%,比缺锌组高出47%。LPZ 组和MZ 组脾脏锌含量无显著性差异,但都显著高于OPZ 组和无机锌组(P<0.05),且基本恢复到正常水平。

图4 不同组别大鼠各脏器锌含量Fig.4 Zinc content of various organs in different groups

2.6 肽锌结合物MZ 对大鼠小肠ZnT1 及PepT1 蛋白表达的影响

锌转运体ZnT1 主要表达部位在小肠绒毛细胞的基底膜表面,其主要功能是将锌转出细胞。大鼠小肠ZnT1 蛋白表达情况如图5所示MZ 组、LPZ 组和OPZ 组大鼠小肠ZnT1 蛋白的表达量与ZS 组差异不是很明显,但都显著高于缺锌组(P<0.05)。如图6小肽转运蛋白PepT1 蛋白表达量MZ 组、LPZ 组和OPZ 组均显著高于ZS 组 (P<0.05),其中MZ 组PepT1 的蛋白表达量最高,相对于无机锌组上调20%。这与Oestreicher 等[18]提出的肽锌复合物可能通过肽的吸收机制被完整吸收的推断相符合。

3 结论

图5 不同锌源对大鼠小肠锌转运体ZnT1蛋白表达水平的影响Fig.5 Effect of different zinc sources on the expression of ZnT1 protein in rat small intestine zinc transporter

图6 不同锌源对大鼠小肠小肽转运蛋白PepT1蛋白表达水平的影响Fig.6 Effect of different zinc sources on the expression of PepT1 protein in rat small intestine zinc transporter

以牡蛎源多肽为基础,通过构建缺锌型SD 大鼠模型,研究了MZ 的生物补锌性。结果表明MZ在促进大鼠增重、维持大鼠血清锌含量及各脏器锌储备量方面的效果均优于OPZ 与硫酸锌,牡蛎源肽(EVPPEEH)与锌结合后促进了锌的吸收利用。锌的主要吸收部位是小肠,肠道中可溶性锌含量与人体锌吸收量成正比[19]。MZ 进入肠道后能减少食物组分对于锌的竞争性结合,促进了机体对于锌的吸收。另外类蛋白反应将谷氨酸等锌结合能力强的氨基酸引入到牡蛎肽中,进一步提高其与锌结合能力和稳定性。大鼠小肠转锌蛋白的表达情况也显示MZ 组与ZS 组的ZnT1 蛋白表达量无差异,说明小肠ZnT1 的表达主要与锌离子相关,MZ 促锌经小肠细胞转运入血的效果与硫酸锌相似,而多肽对于ZnT1 蛋白的表达可能不起作用。小肽转运蛋白的表达量MZ 组显著高于硫酸锌组,说明MZ 可通过肽的吸收机制被完整吸收,进而提高了MZ 在大鼠体内的生物利用性。Gefeller 等[20]也认为,有机锌既可以通过锌转运体调节被吸收,也可以通过小肽或氨基酸的吸收机制被吸收。基于此吸收机理,MZ 可能比传统的补锌产品更好地被人体吸收利用,即MZ 有望成为新型的补锌产品。

综上所述,MZ 的确具有很好的补锌效果,后续工作将通过Caco-2 细胞单层模型,利用锌螯合阻断剂、荧光标记肽锌结合物以及多肽与锌吸收转运相关蛋白的基因表达情况,研究其体外生物可利用性,探讨传统的锌吸收途径和肽作用途径分别在其生物利用中所占的比重及这两种途径之间是否存在协同作用。

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