基于BALB/C小鼠模型评价牛乳αs1-酪蛋白的致敏特性

丛艳君 刘家琦 于晓凤 吕晓哲 李 晔

（1 北京工商大学食品与健康学院 北京食品营养与人类健康高精尖创新中心 北京100048 2 北京工商大学食品与健康学院 食品添加剂与配料北京高校工程研究中心 北京100048）

大约有65%的牛乳过敏病人对酪蛋白过敏，而对酪蛋白过敏的患者主要对αs1-酪蛋白产生过敏反应[1]。本课题组前期通过ELISA、免疫印迹试验研究发现αs1-酪蛋白是我国牛乳过敏患者潜在的过敏原[2]。通过查阅国内外文献发现，目前对牛乳αs1-酪蛋白的检测和评价主要是用体外方法，体内研究报道较少[3-4]。

目前报道的用于过敏性食品评价的动物模型有狗、豚鼠、小鼠和大鼠，最优模型还在研究筛选中[5-11]。狗的肠道解剖、生理和营养需求与人类相似，豚鼠的皮肤、胃肠道的解剖学、生理学和免疫学也与人类相似[12]，然而这种动物与啮齿类动物相比存在一些缺点，如动物喂养费用昂贵、品种有限、市售的免疫试剂缺乏以及漫长的致敏过程（18个月）[13]。经口致敏的牛乳过敏动物模型主要用的是豚鼠[14-15]，然而对于评价蛋白质的致敏性，它不是一种合适的动物模型，因为豚鼠对蛋白质的免疫反应不同于人类[15]，且缺少合适的研究豚鼠免疫系统的工具[12]。与其它动物模型相比，大鼠是毒性试验常用的实验动物之一，具有许多优点[16]。棕色挪威大鼠因与IgE 的高反应特性，故被广泛用于食物过敏的研究（使用或不使用佐剂）。转录分析方法表明小鼠和人类样本之间表现出显著的一致性，特应性皮炎的研究表明小鼠和人类样本在基因表达谱中表现出高度的同源性[17]。此外，小鼠的体积小，繁殖周期短，免疫学特性好。在复杂的过敏反应机制中，还没有找到一种可以定量蛋白质潜在过敏性的稳定的标记物[18]。已经报道的食物过敏动物模型存在诸多不同，如过敏程度、致敏途径、致敏原的类型及用量不同，另外佐剂使用类型及用量也不同[19-22]，这就很难用已有的模型进行食物致敏性评价及治疗方法的筛选。BALB/C 小鼠是以Th2 型细胞应答为主导的，对过敏原更易感而能够产生高效价的IgE，常被用于食物过敏反应的研究[23-24]。有研究显示雌性小鼠的免疫反应性比雄性小鼠更强[25]。

本研究旨在建立αs1-酪蛋白致敏的BALB/C小鼠模型基础上，通过测定小鼠特异性IgE 抗体、肥大细胞蛋白酶、组胺、细胞因子水平，并进行临床和病理切片观察，深入研究αs1-酪蛋白对机体的致敏机理，为评价αs1-酪蛋白致敏风险提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

50 只3～4 周龄SPF 级雌性BALB/C 小鼠，购自北京维通利华公司（许可证号：SCXK（京）2006-0009）；鸡蛋清白蛋白（OVA），上海源叶生物技术有限公司；霍乱毒素（CT），Sigma 公司；HRP-羊抗鼠IgE 抗体，北京拜尔迪生物技术有限公司；1640培养基、青霉素、链霉素和两性霉素B，中科迈晨（北京）科技有限公司；胎牛血清（FBS），Hyclone；肥大细胞蛋白酶试剂盒、组胺试剂盒、细胞因子IL-4 试剂盒、细胞因子IL-5 试剂盒、细胞因子IL-10 试剂盒、细胞因子IFN-γ 试剂盒，武汉华美有限公司。

1.2 仪器、设备及其它

550 型酶标仪，美国Bio-Rad 公司；低温高速离心机，SIGMA 公司。清洁级动物房，中国农业大学食品学院农业部农产品质量监督检验测试中心。

2 方法

2.1 αs1-酪蛋白致敏动物模型的建立

BALB/C 小鼠在SPF 标准的动物房内适应性喂养1 周，期间自由摄食和饮水，环境温度控制在（23±3）℃，湿度控制在40%～70%。小鼠按体重随机分成5 组，每组10 只，分别为卵清白蛋白（ovalbumin，OVA）阳性对照组 （每次灌胃剂量2 mg/只）、αs1-酪蛋白高剂量组（3 mg/只）、αs1-酪蛋白中剂量组（2 mg/只）、αs1-酪蛋白低剂量组（1 mg/只）、生理盐水阴性对照组，其中阳性对照组和αs1-酪蛋白剂量组佐以霍乱毒素（cholera toxin，CT）。前5 周，每隔7 d 经口灌胃αs1-酪蛋白或OVA，阴性对照组给予相同体积的生理盐水。第42 天，小鼠禁食过夜后进行5 倍质量的αs1-酪蛋白或者OVA的大剂量刺激。试验过程中，每周观察小鼠的生长状况。

大剂量刺激30 min 后，观察各组动物的状态，并进行致敏症状评分。评分标准为：0 分：没有异常症状；1 分：小鼠抓鼻子或挠头；2 分：眼睛或嘴巴周围浮肿，毛发竖立，活动减少或呼吸频率增加；3 分：哮喘，呼吸困难；4 分：大刺激后小鼠抽搐或静止；5 分：死亡[20]。

2.2 特异性IgE 抗体的测定

各组动物在第42 天免疫之后30 min 时采血，通过ELISA 方法测定血清中特异性IgE 抗体含量[26]。

2.3 肥大细胞蛋白酶及组胺释放试验[27]

各组动物在第42 天免疫之后30 min 时通过眼窝内眦静脉采血，血浆样本用于组胺水平的测定，血清样本用于肥大细胞蛋白酶水平的测定。分别使用组胺释放试剂盒、肥大细胞蛋白酶ELISA试剂盒参照说明书操作。

2.4 细胞因子的测定[28]

各组动物在第42 天免疫之后30 min 时取脾淋巴细胞，低温500 g 离心5 min，弃去上清，加入1640 完全培养基（90% 1640 不完全培养基，10%胎牛血清），1% 三抗（含有青霉素、两性霉素B 和链霉素）使浓度达到2×105个/mL，取100μL 的细胞悬液加入96 孔细胞培养板中，同时添加或不添加100 μL/mL 的αs1-酪蛋白，添加αs1-酪蛋白孔作为阳性对照。将细胞培养板在CO2细胞培养箱中连续培养72 h 后，收集动物细胞上清液，使用细胞因子试剂盒测上清液中的IL-4、IL-5、IL-10 和IFN-γ 的水平。

2.5 组织病理学观察[29]

大剂量刺激后30 min，颈椎脱臼处死小鼠，解剖取空肠，胸腺，脾脏和肺，在福尔马林溶液固定，石蜡包埋切片，HE 常规染色，观察各脏器是否病变。

2.6 数据分析

试验数据用平均值±标准差（x±s）表示，采用SPSS 19.0 软件进行统计分析，两组均值用t 检验分析，差异水平为P＜0.05。

3 结果与分析

3.1 特异性IgE 抗体的测定

如图1所示，αs1-酪蛋白致敏组小鼠特异性抗体IgE 水平显著升高（P＜0.05），说明成功建立了BALB/C 小鼠模型。OVA 经口灌胃诱发小鼠机体产生特异性IgE 抗体水平也显著升高 （P＜0.05），进一步验证了方法的准确性。并且αs1-酪蛋白致敏组小鼠产生的特异性IgE 抗体水平随着灌胃剂量的增加而增加。

图1 各致敏组小鼠血清中特异性抗体IgE 的光密度值Fig.1 The OD value of specific IgE in sera of sensitized mice

3.2 过敏症状观察

大剂量刺激后30 min 内，各组均有不同数量的小鼠表现出不同程度的过敏症状，阴性对照组有2 只小鼠抓鼻子或挠头，其它8 只小鼠没有过敏症状。各蛋白致敏组小鼠中，低、中、高剂量组均有1 只小鼠未表现出过敏症状，其它小鼠都产生了抓鼻子、挠头、毛发竖立、活动减少等致敏反应，甚至，高剂量组1 只小鼠出现哮喘、呼吸困难症状。没有出现抽搐、死亡症状的小鼠。

表1 各致敏组小鼠出现不同症状的数量Table 1 The number of different symptoms appeared in each sensitized group

3.3 肥大细胞蛋白酶的测定

如图2所示，各试验组的肥大细胞蛋白酶含量都显著高于阴性对照组（P＜0.05），αs1-酪蛋白致敏组小鼠产生肥大细胞蛋白酶的量随着灌胃剂量的增加而增加。与OVA 阳性对照组比较，低剂量组、中剂量组均与之差异显著（P＜0.05），高剂量组差异不显著（P＞0.05）。

图2 各致敏组小鼠血浆中肥大细胞蛋白酶含量Fig.2 The content of mast cell proteinase in plasma of each sensitized group

3.4 组胺释放的测定

如图3所示，αs1-酪蛋白致敏的中、高剂量组小鼠的组胺释放量都显著高于阴性对照组 （P＜0.05），且产生组胺的量随着灌胃剂量的增加而增加，低剂量组与阴性对照组间差异不显著（P＞0.05）。αs1-酪蛋白致敏的中、低剂量组小鼠产生的组胺量显著低于阳性对照组（P＜0.05），高剂量组与阳性对照组差异不显著（P＞0.05）。

图3 各致敏组小鼠血浆中组胺含量Fig.3 The histamine content in plasma of each sensitized group

3.5 细胞因子的测定

各组小鼠第42 天大剂量刺激后，检测脾细胞中IL-4、IL-5、IL-10 和IFN-γ 的水平。

如图4所示，各剂量组小鼠脾淋巴细胞中细胞因子IL-4 含量与阴性对照组相比差异显著（P＜0.05），且αs1-酪蛋白免疫组中IL-4 含量随着致敏剂量的增加呈现增加的趋势。低、中剂量组IL-4含量与阳性对照组相比差异不显著 （P＞0.05），高剂量组IL-4 含量高于阳性对照组，数值为214.18 pg/mL，差异显著（P＜0.05）。

如图5所示，各剂量组小鼠脾淋巴细胞中细胞因子IL-10 含量与阴性对照组相比差异显著（P＜0.05），且αs1-酪蛋白各剂量致敏组IL-10 含量随着致敏剂量的增加而增加。低剂量组和中剂量组小鼠脾淋巴细胞中IL-10 含量低于阳性对照组，数值分别为999.36，1 180.99 pg/mL，差异显著（P＜0.05），高剂量组也低于阳性对照组，数值为1 224.57 pg/mL，但是差异不显著（P＞0.05）。

如图6所示，各剂量组小鼠脾淋巴细胞中IL-5 含量与阴性对照组相比差异显著（P＜0.05），且各剂量组小鼠IL-5 含量随着致敏剂量的增加呈现增加的趋势。低剂量组小鼠IL-5 含量低于阳性对照组，差异显著（P＜0.05），中剂量组小鼠IL-5 含量低于阳性对照组，差异不显著（P＞0.05），高剂量组高于阳性对照组，数值为34.98 pg/mL，差异不显著（P＞0.05）。

如图7所示，各剂量组小鼠脾淋巴细胞中细胞因子IFN-γ 含量与阴性对照组相比均差异显著（P＜0.05），低剂量组小鼠IFN-γ 含量高于阳性对照组，差异显著（P＜0.05），中剂量组小鼠IFN-γ 含量高于阳性对照组，数值为523.80 ng/L，差异不显著（P＞0.05），高剂量组含量低于阳性对照组，数值为509.04 ng/L，差异不显著（P＞0.05）。

图4 各致敏组小鼠脾淋巴细胞IL-4 的分泌情况Fig.4 Secretion of cytokine IL-4 in splenic lymphocyte of each sensitized group

图5 各致敏组小鼠脾淋巴细胞IL-10 的分泌情况Fig.5 Secretion of cytokine IL-10 in splenic lymphocyte of each sensitized group

图6 各致敏组小鼠脾淋巴细胞IL-5 的分泌情况Fig.6 Secretion of cytokine IL-5 in splenic lymphocyte of each sensitized group

图7 各致敏组小鼠脾淋巴细胞IFN-γ 的分泌情况Fig.7 Secretion of cytokine IFN-γ in splenic lymphocyte of each sensitized group

3.6 组织病理学观察

通过组织病理学观察，可以看出阴性对照组的小鼠各脏器均呈现正常形态 （图8，1a、1b、1c、1d），而αs1-酪蛋白各剂量组小鼠的肺、脾脏、胸腺和小肠均有不同程度的炎症变化。αs1-酪蛋白低剂量组的小鼠局部肺泡充气过度，扩张，肺泡隔增宽（图8，2a），脾脏红髓充血，边缘窦有少量淋巴节病灶（图8，2b），胸腺形态未见明显异常（图8，2c），小肠黏膜间质有少量炎细胞浸润（图8，2d）。αs1-酪蛋白中剂量组的小鼠有明显脏器的炎性病理特征。小鼠局部肺泡隔塌陷，少量肺泡代偿性扩张（图8，3a），脾脏红髓充血，边缘窦有较多淋巴灶（图8，3b），胸腺内有淋巴灶产生（图8，3c），小肠黏膜间质有较多炎细胞浸润（图8，3d）。αs1-酪蛋白高剂量组的小鼠脏器的炎性病理特征更为明显。小鼠局部肺泡隔增厚，少量肺泡代偿性扩张，局部肺泡少量出血（图8，4a），脾脏红髓充血，局部边缘窦有条索状淋巴灶（图8，4b），胸腺髓质内有较大的淋巴灶（图8，4c），小肠黏膜间质有较多炎细胞浸润（图8，4d）。

阳性对照组的小鼠脏器的炎性病理特征也较为明显。小鼠局部肺泡隔增厚，肺泡代偿性扩张，充气过度（图8，5a），脾脏红髓充血，有较多淋巴灶，有灶性坏死（图8，5b），胸腺髓质内有较大的淋巴灶（图8，5c），小肠黏膜间质有较多炎细胞浸润（图8，5d）。

图8 各致敏组小鼠肺、脾脏、胸腺和小肠等组织的病理切片Fig.8 Pathological sections of the lung，spleen，thymus and small intestine of the sensitized mice

4 讨论

食物过敏动物试验一个潜在的争议问题是致敏途径的选择，常用的致敏途径是腹腔注射和口服灌胃[30-32]。在不添加佐剂时，注射方式可能比口腔灌胃更易引起动物产生过敏反应，但这与人体经过口腔摄入过敏原后引起机体产生的过敏反应方式不同。口腔灌胃与人体摄入致敏原的方式相似，但易使经过敏原处理的动物产生免疫耐受[33-34]，因此一般会使用相应的佐剂来避免产生耐受，本研究采用CT 作为佐剂。CT 是迄今研究比较深入、效果比较好的黏膜免疫佐剂之一[35]。CT 由一个毒性A 亚单位与五聚体B 亚单位共价连接而成，本研究同之前报道的文献相同[36-37]，用无毒的B 亚单位免疫小鼠，CT-B 与存在于所有有核细胞表面的唾液酸神经节苷脂结合，诱导细胞膜构型改变，同时通过刺激内源性腺苷酸环化酶活性，使cAMP 合成增加而发挥佐剂作用[38]。

T（CD4+）细胞作为过敏效应性细胞，当与牛乳等抗原相遇，能够分化为成熟的效应性TH （Thelper）细胞，并分泌细胞因子，根据分泌的细胞因子不同，可分为Thl 和Th2 细胞，Thl 细胞主要分泌IFN-γ、IL-2 和TNF-α，负责细胞介导的免疫反应，Th2 细胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-10 和IL-13，能够有效激活B 细胞产生IgE 抗体，IgE 与肥大细胞结合导致肥大细胞脱颗粒，释放细胞蛋白酶、组胺等介质，启动针对特异性抗原的过敏反应[39]。细胞蛋白酶、组胺是评价细胞脱颗粒的重要指标[40]。

本研究中αs1-酪蛋白致敏组均可诱发小鼠机体产生特异性IgE 抗体，且显著高于阴性对照组小鼠，这与Fotschki 等[41]用β-乳球蛋白、α-酪蛋白（用铝作为佐剂）致敏BALB/C 小鼠，血清特异性IgE 抗体含量显著升高的结论一致。并且验证了本实验室体外试验发现αs1-酪蛋白具有潜在的致敏性的结论[2]。与阴性对照组小鼠比较，αs1-酪蛋白致敏小鼠的肥大细胞蛋白酶、组胺含量均显著升高，Th2 细胞分泌的IL-4、IL-5、IL-10 水平随着致敏剂量的增加呈现显著增加的趋势。Xuanyi Meng等[42]用α-乳白蛋白免疫BALB/C 小鼠（用CT 作为佐剂），Th2 细胞因子水平显著升高。Hodgkinson等[43]用从山羊奶中分离纯化的αs1-酪蛋白致敏BALB/C 小鼠，建立了动物模型，小鼠血清特异性IgG1 和IgE 含量均显著增高，肥大细胞蛋白酶含量较对照组增加了10 倍，细胞因子IL-4 和IL-10水平显著增加。

本研究数据表明，Th1 细胞分泌的IFN-γ 也呈增加趋势，且高中低剂量组均高于阴性对照组小鼠，Th1 型细胞分泌的以IFN-γ 为主的细胞因子，对Th2 型过敏反应起抑制作用，二者之间互相制约，两亚群之间的平衡是机体免疫调节的基本方式[44]。病理切片结果进一步显示，αs1-酪蛋白中剂量和高剂量组小鼠局部肺泡隔塌陷或增厚，脾脏和胸腺中有淋巴灶产生，且小肠黏膜间质有炎细胞浸润。一般情况下机体的胃肠道特异性和非特异性黏膜屏障系统可以限制蛋白质抗原片段侵入，从而减轻对食物蛋白的过敏反应，但是过敏体质的个体消化道屏障功能较差，食物过敏原片段容易穿过肠黏膜，从而引起炎症反应[45-46]。

卵清白蛋白（OVA）是鸡蛋清中的一种蛋白质，经常引起人发生强烈过敏反应，因此它被作为过敏原广泛用于各种疾病模型[47-49]。本研究结果表明，OVA 致敏的小鼠体温显著降低，分泌的特异性IgE 含量、细胞因子IL-4、IL-5、IL-10、IFN-γ均显著高于阴性对照组小鼠，肥大细胞蛋白酶、组胺含量均显著升高，小鼠的肺、脾脏、胸腺和小肠均有不同程度的炎症变化。同时设置阴性对照组，即用生理盐水代替OVA、αs1-酪蛋白，整个试验过程中，小鼠体温、IgE、肥大细胞蛋白酶、组胺含量均保持稳定状态，小鼠肺、脾脏、胸腺和小肠各脏器均呈现正常形态。

关于食物过敏蛋白的研究方法很多，但动物模型因其能直接、准确的反应食物过敏原致敏特性而被广泛使用。在牛乳过敏研究中，BALB/C 小鼠是常用的动物模型，因为小鼠对牛乳蛋白产生胃肠道过敏反应进而产生特异性IgE 抗体的模式与人类相似[20]，并且有研究表明用牛乳β-乳球蛋白过敏原口服致敏BALB/C 小鼠，可以诱导IgE 抗体显著升高[50-52]。因此本研究选用雌性BALB/C 小鼠评价αs1-酪蛋白致敏特性，首先通过预试验确定小鼠αs1-酪蛋白无致敏剂量及最大过敏致死剂量（用CT 作佐剂），然后确定高中低剂量组进行正式动物试验，试验结果表明BALB/C 小鼠特异性IgE 抗体显著升高，易产生Th2 型细胞因子，并表现出明显的炎症症状，能模拟临床过敏反应的发生而用于食物过敏症研究[53-54]。

5 结论

本研究在建立αs1-酪蛋白致敏的BALB/C 小鼠模型基础上，揭示了αs1-酪蛋白的致敏机理，即αs1-酪蛋白可以诱导小鼠血液中的特异性IgE 抗体、肥大细胞蛋白酶、组胺含量均显著升高，Thl 和Th2 细胞分泌的因子IL-4、IL-5、IL-10、IFN-γ 含量均显著升高，且随着致敏剂量的增加而增加。组织病理切片结果显示，αs1-酪蛋白中、高剂量组小鼠均产生了明显的炎症反应，局部肺泡隔塌陷或增厚，脾脏和胸腺中有淋巴结病灶产生，且小肠黏膜间质有炎细胞浸润。