短乳杆菌AR247的抗氧化成分及其抗衰老作用

林祥娜 王光强 杨昳津 熊智强 艾连中 夏永军

（上海理工大学医疗器械与食品学院 上海食品微生物工程技术研究中心 上海200093）

氧化应激是当机体产生的活性氧（reactive oxygen species，ROS）和体内的抗氧化防御系统不平衡时导致的[1-2]。当活性氧的含量积累过多，超过内源性的清除剂的中和能力后，机体内的蛋白质、核酸、细胞等易受到氧化损伤，从而会引起多种与氧化应激相关的疾病，例如炎症、癌症、帕金森、阿兹海默和动脉粥样硬化等疾病[3-8]。可添加不同类型的抗氧化剂去减轻或者阻止胞内氧化损伤，从而帮助机体减轻氧化损伤[9]。尽管目前一些合成的抗氧化剂如叔丁基羟基茴香醚 （Butylated Hydroxyanisole，BHA）、2，6-二叔丁基对甲酚（Butylated Hydroxytoluene，BHT）等广泛地用于阻滞脂质过氧化，但是损伤肝脏导致它们的安全性受到质疑。目前从自然界中开发天然、安全、可代替合成抗氧化剂的天然抗氧化剂受到极大的关注。

乳酸菌（Lactic Acid Bateria，LAB）是一类可发酵糖水化合物产生乳酸的革兰氏阳性菌的统称。近年来，国内外不少报道称乳酸菌具有抗氧化作用，Kullisaar 等[7]研究发现具有抗氧化活性的菌株发酵乳杆菌 （Lactobacillus fermentum）E-3 和E-8 在一定浓度的过氧化氢中存活时间较长；Li等[9]研究发现植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）C88 有较高的清除羟基自由基和DPPH 自由基的能力，清除率分别为44.31%和53.05%；Kuda 等[10]研究发现乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）S-SU2 有较高的对超氧根离子的清除能力，且植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）S-SU1 的灭活菌体对3 mmol/L H2O2损伤的酿酒酵母细胞有保护作用。关于乳酸菌的抗氧化研究虽然很多，但是对其抗氧化成分及其抗氧化机制并没有系统的阐述。

前期研究表明，短乳杆菌AR247 具有较好的抗氧化活性，其菌体对DPPH 和O2-·的清除力分别为（48.95±0.17）%和（26.85±0.05）%，且其能抗脂质过氧化，对酵母细胞具有一定的保护作用[11]。本文研究了具有抗氧化活性的短乳杆菌AR247不同组分的抗氧化能力，并进一步研究了短乳杆菌AR247 对D-gal 致衰老的氧化小鼠的保护作用，测定其血清、肝脏和脑组织中的过氧化氢酶（catalase，CAT）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活力和谷胱甘肽（glutathione，GSH）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）的含量，同时测定小鼠血清中的白介素2 （interleukin 2，IL-2）、肿瘤坏死因子α（tumour necrosis factor，TNFα）含量，以期为开发具有抗氧化性的功能性食品提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

上海理工大学食品生物技术研究所分离保藏的短乳杆菌AR247（CGMCC 12786）。

菌株活化培养基、发酵培养基：液体MRS 培养基，按文献配制[12]。

固体MRS 培养基：液体MRS 培养基加1.5%的琼脂粉。

正己烷、正丁醇、乙酸乙酯：国药集团化学试剂有限公司。D-半乳糖、LiCl：上海生物工程有限公司。胃蛋白酶、胰酶：上海源叶生物科技有限公司。

ICR 小鼠：雄性，体质量（20±2）g，SPF 级，购于上海杰思捷实验动物有限公司。

过氧化氢酶 （CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶 （SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）、白介素2（IL-2）、肿瘤坏死因子（TNF-α）试剂盒：南京建成生物工程研究所。

1.2 仪器与设备

3-18 K 型离心机，德国sigma 公司；分光光度计，上海美谱达仪器有限公司；恒温培养箱，上海一恒；厌氧培养箱，英国Ruskin 公司；恒温水浴锅，上海一恒；超净工作台，苏州净化；酶标仪，奥地利Molecular Devices。

1.3 方法

1.3.1 菌株的活化以及无细胞提取物和完整细胞菌体的制备 将冻藏在-80 ℃的短乳杆菌AR247传代3 次，以1%的接种量接种于100 mL 培养基中，37 ℃培养18 h 后，在4 ℃、6 000 r/min 的条件下离心10 min，分离得到无细胞提取物，-20 ℃放置备用；将菌体用无菌PBS 洗涤3 次后重悬于PBS 中，调整菌体浓度为1.0×109CFU/mL，此即完整菌体细胞。

1.3.2 萃取样品的制备 将得到的无细胞提取物置于分液漏斗中，采用极性依次增大的有机溶剂正己烷、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取，每次萃取到有机相无明显颜色为止。分别得到正己烷相、乙酸乙酯相、正丁醇相、水相，如图1。

图1 无细胞提取物的连续萃取Fig.1 Continuous extraction of cell free extracts

1.3.3 菌体部分的处理 根据Li[9]的研究，稍有改动。将上述得到的完整菌体细胞分成6 组，其处理如下：在第1 组菌体中加入200 μL 20 mg/mL 的溶菌酶37 ℃处理30 min，随后在冰浴条件下进行超声波破碎，破碎参数如下：超声5 s，停歇5 s，功率40%，超声工作时间10 min。超声结束后在4℃，6 000 r/min 离心10 min，取上清，即为胞内物质，沉淀加无菌水至原来体积；第2 组加入0.5 mg/mL 的胰酶；第3 组加入0.5 mg/mL 的蛋白酶K；第4 组加入5 mol/L 的氯化锂；第5 组加入10 g/L 的偏高碘酸钠；第6 组不处理，做空白对照。将2，3，4，5，6 组放置在37 ℃下培养30 min，随后在4 ℃，6 000 r/min 离心10 min，取上清，沉淀加无菌水至原来体积，备用。

1.3.4 DPPH 清除能力的测定 据文献[12]，稍有改动。取不同样品各2 mL，加入浓度为0.2 mmol/L的DPPH 无水乙醇溶液1 mL，混匀后置于室温下避光反应30 min，然后在6 000 r/min 下离心10 min，取上清液在517 nm 下测定吸光度Ai，平行测定3 次，取平均值。空白组以等体积无水乙醇代替DPPH 溶液，测得吸光度（Aj）；对照组以等体积蒸馏水代替样品溶液，测得吸光度（A0）；并以等体积蒸馏水和无水乙醇混合液空白调零。

1.3.5 试验动物及分组 将40 只小鼠饲养于动物房，12 h 光照/12 h 黑暗，相对湿度40%～60%，室温（23±2）℃，自由进食和饮水，适应性饲养一周后，分组，每组10 只，即：（1）正常组；（2）模型组；（3）阳性对照组；（4）短乳杆菌AR247 组。正常组小鼠皮下注射生理盐水，其它组小鼠皮下注射浓度为150 mg/kg 体重/天的D-半乳糖，注射6周。6 周后开始灌胃，阳性对照组灌胃10 mL/kg 体重浓度为1 mmol/L 的VC。短乳杆菌AR247 组灌胃10 mL/kg 体重的浓度为1.0×109CFU/mL 的短乳杆菌AR247，正常组和模型组灌胃等量的生理盐水，连续灌胃6 周。

1.3.6 小鼠试验样本的采集 最后一次给药12 h 后，称重，取眼球取血，引颈处死小鼠，迅速取肝和脑用生理盐水冲洗干净，滤纸吸去水分后，称量，器官指数为器官质量与体重的比值。血液于4℃、3 000 r/min 离心10 min，收集血清，用于血清生化指标的测定。器官用预冷PBS 制成10%的组织匀浆，于4 ℃、3 000 r/min 离心10 min 后取上清，用于组织生化指标的测定。

1.3.7 血清和组织中的抗氧化酶活力的测定 血清、肝、脑组织匀浆的CAT、SOD、GSH-Px 活力和MDA 及GSH 含量测定按照试剂盒说明书的方法进行。血清里的IL-2 和TNF-α 按照试剂盒说明书的方法进行测定。

1.4 数据处理

所有数据均用 “平均值±标准差”（mean±SD）表示，采用SPSS 22.0 数据分析软件进行显著性差异分析，采用LSD 最小显著性差异法分析其差异性，P＞0.05 无显著性差异，P＜0.05 有显著性差异，P＜0.01 有极显著差异。

2 结果与分析

2.1 连续萃取的无细胞提取物对DPPH 自由基的清除能力

二苯基苦基苯肼（DPPH）自由基是一种常见的评价抗氧化效果的测定方法[13]。DPPH 是一种稳定的自由基，其乙醇溶液呈紫色，加入抗氧化物质后，其在517 nm 处有较强吸收，可通过这一变化评价物质的抗氧化能力。

由表1可以看到，把短乳杆菌AR247 的无细胞提取物按极性依次增大的有机溶剂正己烷、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取，每次萃取到有机相无明显颜色为止，分别得到正己烷相、乙酸乙酯相和正丁醇相，以及最后剩余的水相，经过逐级连续萃取，DPPH 自由基清除率最高的为水相，清除率为90.82%±1.21%，较空白MRS 明显提高，极性最小的正己烷相的清除率最小，仅为2.7%±0.6%，乙酸乙酯相的清除率高于正丁醇相推测是无细胞提取物中的抗氧化物质被乙酸乙酯萃取出来，故下一级的正丁醇相清除率较低，但萃取完成后的水相清除率仍较高，这表示无细胞提取物中的抗氧化成分多在水溶液中。

表1 连续萃取的无细胞提取物对DPPH 自由基的清除能力Table 1 DPPH radical scavenging activity of continuous extraction of cell free extracts

2.2 菌体不同处理方法对DPPH 自由基的清除率

有文献报道，益生菌中的抗氧化酶如超氧化物歧化酶（SOD）、含锰假性过氧化氢酶（Mn-Kat）、谷胱甘肽过氧化物酶（GP）以及硫氧还蛋白还原酶（TrxR）具有清除活性氧（ROS）和自由基作用[15]。对短乳杆菌AR247 的菌体进行不同的处理分析，结果如表2所示，不同菌体成分的DPPH 清除率能力不同，其中第6 组作为不加处理的完整细胞悬液来作为对照组。第1 组对菌体进行了破壁处理，使细胞内容物溶出，其清除率高达85.70% ±1.70%，与空白相比明显提高，说明其内容物抗氧化能力较强；第2 组用胰酶处理了菌体表面的蛋白，使细胞的粘附性变差，其清除率为47.22%±1.23%，与对照组相比其清除率并无显著性差异；第3 组用蛋白酶K 处理菌体后，其表面蛋白质被降解，其菌体清除率与对照组相比无显著性差异，但上清中蛋白质降解产物的清除率提高至35.30%±0.80%；第4 组用LiCl 处理菌体，将菌体表面的S 层蛋白去除后，清除率降至25.79% ±0.88%，S 层蛋白的清除率为8.70%±1.21%。说明表面的S 层蛋白并非是主要抗氧化组分。第5 组用具有强氧化的偏高碘酸钠处理菌体表面，加入偏高碘酸钠后，表面的多糖被氧化，其清除率为43.98%±0.67%，与对照组并没有显著性差异，证明其表面多糖并不是主要的抗氧化成分。综上，短乳杆菌AR247 的胞内成分以及菌体表面的荚蛋白具有一定的抗氧化性，且发现短乳杆菌AR247胞内物质的清除DPPH 自由基能力最强，这与之前的文献报道相吻合。

2.3 短乳酸菌AR247 对小鼠体重和器官指数的影响

在一定时间内，连续给动物注射D-半乳糖，使动物机体内半乳糖浓度增高，使其在醛糖还原酶的催化下还原成半乳糖醇，后者不能进一步代谢而堆积在细胞内，影响正常渗透压，导致细胞肿胀和功能障碍，最终引起衰老[16]。这与正常衰老的过程较为相似，是衰老研究中常用的一种模型，构建简单，且成功率高[17-18]。

表2 菌体不同处理方法对DPPH 自由基的清除率（%）Table 2 DPPH radical scavenging activity of different treatment on intact bacteria （%）

试验期间各组小鼠均自由饮食、饮水，正常组小鼠生长状况良好，模型组小鼠出现掉毛，毛发失去光泽，反应迟钝，所有小鼠未发生意外损伤和死亡。由表3可发现，试验结束后，模型组小鼠体重较正常组显著下降，灌胃VC 和短乳杆菌AR247后，体重恢复至正常水平；模型组的肝脏和脑指数与正常组相比均显著下降，其中灌胃短乳杆菌AR247 后，脑指数恢复至正常水平。

表3 短乳杆菌AR247 对衰老小鼠体重和器官指数的影响（±s，n=10）Table 3 Effect of L.brevis AR247 on weight and organ index in D-galactose induced aging mice （±s，n=10）

表3 短乳杆菌AR247 对衰老小鼠体重和器官指数的影响（±s，n=10）Table 3 Effect of L.brevis AR247 on weight and organ index in D-galactose induced aging mice （±s，n=10）

注：* 表示与模型组相比有显著性差异，P＜0.05。

?分组 试验前体重/g 试验结束时体重/g 脑指数/% 肝指数/%正常组 28.14±0.90 38.43±2.15* 1.42±0.06* 4.41±0.25*模型组 28.56±1.46 35.83±1.79 1.24±0.13 3.35±0.16阳性对照组 28.00±1.53 38.17±3.20* 1.30±0.04 4.31±0.57*短乳杆菌AR247 组 27.83±1.47 38.61±1.66* 1.45±0.07* 3.59±0.16

2.4 短乳杆菌AR247 对小鼠MDA 含量的影响

在正常情况下，自由基的生成和清除处于一个动态平衡的状态，机体有一套防御体系，包括非酶系统如谷胱甘肽、VC、硒等，酶防御系统如超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶等，抵抗自由基的攻击[4，19-21]。当机体内自由基超过机体清除能力时，可导致脂质过氧化，MDA 是脂质过氧化的副产物之一，其含量，表征了细胞和器官的氧化应激水平[14，22-24]。

MDA 是脂质过氧化的产物之一，其含量表征了细胞和器官的氧化应激水平[14]。由图2可以看到，模型组的肝脏和脑中的MDA 含量显著高于正常组，分别为10.77 ± 1.22 和4.33 ± 1.32，衰老模型构建成功。灌胃VC 和短乳杆菌AR247 后，肝脏中MDA 含量显著降低，分别降低至正常组的82.38%和66.13%；短乳杆菌AR247 处理后，脑中的MDA 含量恢复至正常水平。说明短乳杆菌AR247 可缓解小鼠肝脏和脑的氧化应激。

图2 短乳杆菌AR247 对衰老小鼠的丙二醛含量的影响（±s，n=10）Fig.2 Effect of L.brevis AR247 on MDA in D-galactose induced aging mice （±s，n=10）

2.5 短乳杆菌AR247 对小鼠血清中的抗氧化水平的影响

SOD、CAT 和GSH-Px 是机体中非常重要的抗氧化酶，可清除体内自由基和活性氧，以及减少过氧化脂质的形成[25-27]。

表4 短乳杆菌AR247 对小鼠血清中的抗氧化水平的影响（±s，n=10）Table 4 Effect of L.Brevi s AR247 on antioxidant status in serum （±s，n=10）

表4 短乳杆菌AR247 对小鼠血清中的抗氧化水平的影响（±s，n=10）Table 4 Effect of L.Brevi s AR247 on antioxidant status in serum （±s，n=10）

注：* 表示与模型组相比有显著性差异，P＜0.05。

?分组 SOD/U·mL-1 GSH-Px/U·mL-1 CAT/U·mL-1 GSH/mg·L-1正常组 24.56±0.52* 180.73±5.90* 5.24±2.72* 58.04±11.48*模型组 23.71±0.64 155.50±9.52 0 5.10±0.04阳性对照组 22.85±0.56 169.68±3.27* 5.57±1.00* 14.54±4.02短乳杆菌AR247 组 23.12±0.49 168.76±1.62* 1.77±0.70 7.99±2.60

由表4可见，灌胃短乳杆菌AR247 后，血清中的GSH-Px 活力与模型组对照，显著提高（P＜0.05），提高至正常组的93.99%，CAT 活性和GSH含量虽有增加，但未有统计学差异（P＞0.05）；灌胃VC 后，其GSH-Px 和CAT 显著高于模型组（P＜0.05），GSH 含量虽有增加，但未有统计学差异（P＞0.05）；所有组中的SOD 的活性除正常组明显高于模型组（P＜0.05）外，灌胃VC 和短乳杆菌AR247并无统计学差异（P＞0.05）。

2.6 短乳杆菌AR247 对小鼠肝脏中的抗氧化水平的影响

如表5所示，与模型组相比，灌胃短乳杆菌AR247 后，其肝脏中的SOD、GSH-Px 活性以及GSH 含量均有显著性提高（P＜0.05），分别提高至正常组的68.29%，132.86%和77.94%，且高于阳性对照组；CAT 的活性较模型组有提高，但无统计学差异（P＞0.05）。

表5 短乳杆菌AR247 对小鼠肝脏中的抗氧化水平的影响（±s，n=10）Table 5 Effect of L.brevis AR247 on antioxidant status in liver （±s，n=10）

表5 短乳杆菌AR247 对小鼠肝脏中的抗氧化水平的影响（±s，n=10）Table 5 Effect of L.brevis AR247 on antioxidant status in liver （±s，n=10）

注：* 表示与模型组相比有显著性差异，P＜0.05。

?分组 SOD/U·mg-1 蛋白 GSH-Px/U·mg-1 蛋白 CAT/U·mg-1 蛋白 GSH/mg·mg-1 蛋白正常组 158.40±7.78* 1 342.42±219.61* 264.72±42.62* 198.16±10.85*模型组 53.82±5.01 350.00±108.34 56.90±13.70 124.39±11.50阳性对照组 82.87±13.40* 1 527.33±70.91* 74.57±10.56 135.95±88.33短乳杆菌AR247 组 108.17±6.33* 1 783.22±122.11* 61.29±16.20 154.44±6.37*

2.7 短乳杆菌AR247 对小鼠脑中的抗氧化水平的影响

由表6可见，与模型组相比，灌胃短乳杆菌AR247 后，其脑中的SOD 活性和GSH 含量均有显著性提高（P＜0.05），且恢复至正常水平；GSHPx 和CAT 的活性较模型组稍有提高，但无统计学差异（P＞0.05）。阳性对照对脑的氧化损伤也未见显著改善。

表6 短乳杆菌AR247 对小鼠脑中的抗氧化水平的影响（±s，n=10）Table 6 Effect of L.brevis AR247 on antioxidant status in brain （±s，n=10）

表6 短乳杆菌AR247 对小鼠脑中的抗氧化水平的影响（±s，n=10）Table 6 Effect of L.brevis AR247 on antioxidant status in brain （±s，n=10）

注：* 表示与模型组相比有显著性差异，P＜0.05。

分组 SOD/U·mg-1 蛋白 GSH-Px/U·mg-1 蛋白 CAT/U·mg-1 蛋白 GSH/mg·mg-1 蛋白正常组 17.96±3.82 23.60±2.96* 66.88±1.70* 75.40±5.12*模型组 12.96±0.38 8.32±2.53 34.52±1.85 38.02±2.90阳性对照组 16.14±2.58 14.22±4.38 78.99±12.54* 47.50±5.65*短乳杆菌AR247 组 20.13±2.34* 12.39±1.79 46.99±25.64 70.11±3.74*?

2.8 短乳杆菌AR247 对小鼠免疫水平的影响

细胞因子IL-2 和TNF-α 是两个重要的介导免疫反应的细胞因子。IL-2 具有很多的免疫增强作用，如促进T、B 细胞、NK 细胞和单核细胞的增殖，增强T 细胞、NK 细胞的细胞毒性。TNF-α 是一种具有抗肿瘤和免疫调节活性的细胞因子，被认为是一种重要的宿主防御肿瘤的细胞因子[28]。如图3所示，与模型组相比，短乳杆菌AR247 可以显著提高IL-2 的含量（P＜0.05），提高至正常组的104.50%，优于VC；但其TNF-α 与模型组没有统计学差异（P＞0.05），而VC 组恢复TNF-α 至正常水平。

图3 短乳杆菌AR247 对小鼠免疫的影响（±s，n=10）Fig.3 Effect of L.brevis AR247 on immune function （±s，n=10）

3 结论

研究指出，自由基是机体的正常代谢产物，在平衡状态下对机体没有损伤，但平衡打破后，自由基便会产生破坏作用，引起疾病。

本试验通过对已知具有抗氧化活性的短乳杆菌AR247 的无细胞提取物、菌体表面成分和胞内组分进行分析，得到了其胞外的抗氧化成分多在水溶液中，同时胞内的抗氧化能力也很高的结论，但具体成分仍需要进一步试验证明。

本文进一步研究了短乳杆菌AR247 对D-半乳糖诱导的早衰小鼠的保护作用，结果表明，短乳杆菌AR247 能够显著提高衰老小鼠体重和脑指数，提高血清、脑组织和肝组织的SOD 活性、GSH-PX 活性、CAT 活性，降低MDA 含量，其中肝脏中MDA 含量降至正常组的66.13%，表明短乳杆菌AR247 可延缓衰老小鼠机体器官退化，可清除机体内的自由基和活性氧，以及提高抗氧化酶活力，且可提高机体的免疫水平。综上所述，短乳杆菌AR247 具有抗氧化性和抗衰老作用，其机制可能与改善机体的抗氧化功能和增强免疫功能有关。本试验对短乳杆菌AR247 抗衰老作用的研究，为深入探讨其抗衰老机理提供理论基础和试验依据，为进一步开发延缓衰老的功能性食品提高依据。