广东潮汕地区汉族人群中MAFB基因rs6102085位点多态性与非综合征性唇腭裂的关联

何运铺 郑玉倩 陈建欢 唐世杰 黄丽衡

唇腭裂是人类常见的先天性畸形之一，在中国其发生率在1/700。随着地区、民族与性别的不同，其发生率存在差别[1]，在我国出生畸形的发病率中位于第二，唇裂的发病率约1.37‰，腭裂约0.29‰。

近十年以来，已报道了亚洲地区相关候选基因有23 个[2-7]，部分基因获得了关联性研究和连锁性研究的证据，但是，这部分研究仍需要在其他地区或种族中进一步深入研究。v-maf肌腱膜纤维肉瘤癌基因同源物B(v-maf musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homolog B,MAFB)rs6102085在Beaty等[8]报道的全基因组关联研究中更是达到基因组水平显著性，Zhang等[9]报道了MAFBrs6102085在中国西部汉族人群未发现有关联，Huang等[10]报道MAFBrs6102085位点多态性与中国人群发病有关。MAFBrs6102085位点与中国人群中的唇腭裂是否有关联，在中国不同地区结果存在差异，在中国广东潮汕地区汉族人群研究很少，尤其是其与NSCL/P亚型和性别的关联在中国广东潮汕地区汉族人群还未见明确报道。本实验收集2008年6月～2010年9月在汕头大学医学院第二附属医院整形外科住院的广东潮汕地区唇腭裂患者430 例和450 例健康者，探讨广东潮汕地区汉族人群MAFBrs6102085位点与唇腭裂的关联。

1 对象与方法

1.1 研究对象

430 例病例中有46 例性别和亚型不详，其余384 例样本中男性256 例，女性128 例，年龄3 月～36 岁，唇裂73 例，唇裂合并腭裂255 例，腭裂56 例。对照组450 例(排除了综合征性唇腭裂，其它遗传病和家系中无唇腭裂患者，健康者间无血缘关系)，男性207 例，女性239 例，年龄20～60 岁(有4 例性别不详)。性别或亚型不详者，在相应的性别、亚型或关联分析中排除。研究样本均来自广东省粤东潮汕语系地区。抽取静脉血5 ml，用2% EDTA抗凝剂抗凝。本实验获得了汕头大学医学伦理委员会的批准，患者和健康组家属均签署了研究知情同意书。

1.2 DNA提取

用DP-318-03 血样DNA提取试剂盒(北京天根生化科技公司)，按说明书操作步骤，在静脉血中提取血液基因中的DNA。100 μl的静脉血可以提取出20～50 ng的DNA。

1.3 单核苷酸多态性基因型检测

用于检测MAFBrs6102085的TAQMAN 单核苷酸多态性(SNP)基因型分型测定试剂 (TAQMAN®,APPLIED BIOSYSTEMS,ABI公司，USA) 检测SNP序列见表1。SNP检测均使用了荧光标记的5-核酸酶法，试剂有TAQMAN SNP基因型分型测定试剂及TAQMAN PCR 混合试剂。每一个反应体系中都含有12 ng的基因组DNA，3 μl的TAQMAN 反应混合试剂，0.15 μl的20×TAQMAN 多态性位点基因型检测试剂，以及1.65 μl蒸馏水，总反应体积为6.0 μl。REAL-TIME PCR在iQTM5 REAL-TIME PCR仪(ABI公司，USA)上进行，对目标序列进行扩增，REAL-TIME PCR扩增过程中，96 个孔的光学PCR板置于PCR仪上，用 IQTM5 OPTICAL SYSTEM SOFTWARE VERSION-1.0作基因型结果研究分析，此过程运用了等位基因识别的模式(具体操作步骤按说明书)。

表1 MAFB rs6102085位点的基因型检测序列

1.4 统计学分析

用SPSS 15.0统计学分析软件、HAPLOVIEW 4.2遗传统计学软件进行分析。在健康组中用HAPLOVIEW 4.2分析SNP的哈迪-温伯格平衡(HWE)。SNP的基因型频率通过计数得出，等位基因频率由基因型推算出。用SPSS 15统计学软件进行卡方检验，对唇腭裂组和健康组的单核苷酸多态性基因型频率和等位基因频率进行对比，分别对亚型和性别分组进行对比，计算95%置信区间、优势比和P值。

2 结 果

2.1 HWE

健康组中SNP基因型频率符合HWE(P>0.05)，提示所纳入的健康组具有代表性(表2)。

表2 健康组的哈迪-温伯格平衡

2.2 唇腭裂组和健康组等位基因与基因型对比

唇腭裂组中MAFBrs6102085的GG基因型频率(P<0.000 1，OR=1.943)与健康组对比显著增高，G等位基因频率(P=1.22×10-6，OR=1.6)与健康组对比显著增高，差异有显著性统计学意义(表3～4)。

表3 唇腭裂组和健康组基因型

2.3 唇腭裂临床亚型组和健康组等位基因与基因型对比

①唇裂合并腭裂组中MAFBrs6102085的GG基因型频率(P<0.000 1，OR=2.154)和G等位基因频率(P<0.000 1，OR=1.862)与健康组对比均显著增高，差异有显著性统计学意义；②单纯唇裂和单纯腭裂组与健康组对比无统计学意义(P>0.05)(表5～6)。

表4 唇腭裂组和健康组等位基因

表5 唇腭裂组临床亚型和健康组基因型

表6 唇腭裂组临床亚型和健康组等位基因

2.4 男性唇腭裂组和健康组等位基因与基因型对比

rs6102085的G等位基因频率(P<0.000 1，OR=1.716)和GG基因型频率(P<0.000 1，OR=2.660)与健康组对比增高，差异有显著统计学意义(表7～8)。

表7 男性唇腭裂组和健康组基因型

2.5 女性唇腭裂组和健康组等位基因与基因型对比

rs6102085的G等位基因频率(P=0.032)和GG基因型频率(P=0.046)与健康组对比增高(P<0.05)有统计学意义(表9～10)。

表8 男性唇腭裂组和健康组等位基因

表9 女性唇腭裂组和健康组基因型

表10 女性唇腭裂组和健康组等位基因

3 讨 论

利用病例-对照分析，本研究探讨了中国广东地区汉族MAFBrs6102085位点与先天性唇腭裂的关系并对不同临床亚型进行了研究分析，结果表明该单核苷酸多态性与先天性唇腭裂存在显著关联，并且首次发现了在唇裂合并腭裂亚型中存在显著关联，而在单纯唇裂和单纯腭裂中未发现关联。同时我们还发现在男性病例中，MAFBrs6102085位点与先天性唇腭裂的关联性更为明显。

近年来国内外学者对MAFB多态性进行大量的研究，发现MAFB有多个位点与唇腭裂有关。研究表明在中国西部地区、华东地区及东北人群中，均发现MAFB与唇腭裂有关联[11-13]。但是到目前为止，在中国广东潮汕地区汉族人群中MAFBrs6102085位点与唇腭裂的发生是否存在关系还没有被明确报道过。Beatyt等[8]报道亚洲和欧洲一部分人群rs6102085与唇腭裂的发病有关联(P= 1.11×10-14)，但其中未包括中国广东人群。程红球等[14]报道rs17820943多态性与南方汉族地区人群的非综合征唇腭裂易感性有关联，兰菲菲等[15]报道MAFBrs13041247位点多态性与广东地区唇腭裂发病相关，Huang等[10]报道rs6102085多态性与中国人群唇腭裂发病有关系，马丽娟等[16]报道了MAFB基因(rs6072081、rs6065259、rs17820943、rs11696257)在宁夏回汉族人群与非综合征性唇腭裂有关联，马丽娟等对这4个位点进行临床亚型分析发现了宁夏回汉族人群与单纯唇裂和唇腭裂组有关联，与单纯腭裂无关联，但均未对非综合征唇腭裂rs6102085位点多态性的临床亚型及性别进行分析。广东省潮汕人群的民族、地域、血缘、文化相同，人群混杂因素影响较小，本研究发现首次在中国广东潮汕地区汉族人群报道了MAFBrs6102085多态性与唇腭裂有关联，并对临床亚型及性别进行分析。

本研究发现MAFBrs6102085与唇腭裂的发生存在关联， rs6102085的GG基因型频率(P=1.27×10-5)与健康组对比显著增高，G等位基因频率(P=1.22×10-6)与健康组对比显著增高，结果表明含有GG基因型的人群比不含有的人群风险性更高。在唇腭裂临床亚型组，rs6102085的GG基因型(P=8.37×10-7)、G等位基因(P=0.000 1)与唇裂合并腭裂的发生有关联。rs6102085的G等位基因和GG基因型与单纯腭裂和唇裂无关联(P>0.05)。这说明在不同亚型以及疾病严重程度上，该单核苷酸多态性存在不同程度的相关性。在男性组和女性组，rs6102085与男性有关联(基因型P=1.15×10-4，等位基因P= 5.64×10-5)， 与女性无显著关联(基因型P=0.046，等位基因P=0.032)。尽管女性患者的样本量可能较小，但其较小的OR值提示性别差异的存在。本研究通过病例对照研究，证实了MAFB基因rs6102085位点的突变和广东省潮汕人群非综合征性唇腭裂的发生有较强的关联，此研究希望为潮汕人群唇腭裂的产前诊断和预防提供科学依据，为有唇腭裂患者的家庭提供有效的遗传咨询，从而降低唇腭裂的发生率。对于基因的连锁不平衡，程度存在潜在不一样，本研究不能完全评估基因中其它没有被列入检测的基因单核苷酸多态性对唇腭裂的发病风险。