0.1%纳米银溶液作为根管封药对犬慢性根尖周炎愈合的影响

姚丽萍 原小慧 刘杰 王晓荣 卢志山

根管消毒是根管治疗术的重要步骤，通过根管消毒起到进一步杀灭根管机械预备后根管内残余细菌。药物消毒是最常用的根管消毒方法，氢氧化钙是目前最主要的根管内消毒药物[1]。有研究表明，由于氢氧化钙渗入牙本质小管深度有限，导致其不能持续有效的杀菌[2]、对粪肠球菌和白色念珠菌的抑菌效果较差，对生物膜的效果也存在争议[3]，而且，氢氧化钙糊剂封药后难以彻底清除，影响根管充填封闭的严密性[4]。有必要进一步探寻安全、高效的根管消毒药物以抑制根管预备后根管系统中残余细菌并杀灭已经形成生物膜的细菌。

纳米银微粒具备超强的抗菌能力，可以杀死包括金黄色葡萄球菌、肺炎杆菌、大肠杆菌等在内的多种细菌以及真菌、支原体、衣原体等致病微生物材料和方法[5]，与传统抗生素相比极少产生耐药性是一很大的优势[6]。研究表明，纳米银对离体牙牙本质表面粪肠球菌生物膜有较强的渗透能力和杀菌作用，其杀菌作用随处理时间的延长而增强，是一种新型有效的根管消毒药物[7]。纳米银制剂在口腔医学领域的应用也越来越广泛，在口腔溃疡[8]、种植体表面涂层[9]、树脂材料[10]等方面的研究正逐步深入，本实验通过构建Beagle犬慢性根尖周炎动物模型，探讨0.1%纳米银溶液作为根管封药对根尖周病变愈合情况、及根尖周组织炎症刺激性的影响，以期为探寻新型有效的根管消毒药物提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂、仪器和实验动物

3 只12 个月龄，体重在10～12 kg的成年Beagle犬(仪征安立卯生物科技有限公司),无龋齿及牙周病；纳米银(粒径60～120 nm，上海麦克林试剂)；CBCT(合肥美亚光电技术有限公司)；便携式电动牙钻机、ProTaper镍钛根管、直径1 mm球钻(Dentsply公司，美国)；速眠新II(敦化市圣达动物药品有限公司)；次氯酸钠(天津北联精细化学品开发有限公司)；氢氧化钙(天津中鼎生物医学科技有限公司)；总RNA提取试剂盒(B511321，上海生工)；SYBRGreen PCR试剂盒(AQ131)、逆转录试剂盒(AE311，北京全式金)。

1.2 比格犬慢性根尖周炎动物模型的构建

本实验通过动物伦理委员会认证。按照每公斤0.08～0.10 ml的剂量，对Beagle犬进行肌肉注射速眠新II，待犬均完全麻醉后将四肢固定于手术台上，采取仰卧位，用75%的乙醇于右侧上下颌区域进行内外消毒，然后在上颌第二、第三前磨牙，下颌第二、第三、第四前磨牙颊舌侧注射5%利多卡因5 ml，进行局部浸润麻醉。按照Silva等[11]的方法构建犬慢性根尖周炎动物模型。将上述共30 颗前磨牙开髓，给予拔髓，开放于口腔中7 d，使细菌感染根管。 7 d后，按照上述方法全麻下，使用Fuji玻璃离子封闭开髓口。在45 d左右完成模型建立。

拍摄CBCT(89 kV， 10 mA， 扫描时间15 s)，将扫描后图像数据(DICOM格式)导入计算机配置为Dell Precision T7600台式工作站(中央处理器E5-2643，内存32 G DDR3，Win7旗舰版64位操作系统)，软件Mimics 21(Materialise，Leuven，比利时)进行牙齿及根尖周透射影的三维重建，并测量根尖周透射影的体积。

1.3 实验分组

将上述建立的30 颗Beagle犬慢性根尖周炎前磨牙，随机分为3 组，每组10 颗牙齿，分别为0.1%纳米银溶液组、氢氧化钙组、空白对照组。

1.4 根管预备及根管封药

将Beagle犬全麻，去除暂封物，依据CBCT中牙尖到根尖止点距离减去1 mm作为工作长度，采用冠向下法，使用ProTaper旋转镍钛锉进行根管预备至F1。1%次氯酸钠冲洗，无菌纸尖干燥根管。按照下列的方法进行根管封药：① 0.1%纳米银溶液组：将0.1 g纳米银粉放入100 ml去离子水中，超声震荡20 min，制成0.1%纳米银悬浊液。使用1 ml、 规格27 号针头无菌注射器将纳米银溶液注入根管内，使用15#K锉上下提拉20 次，去除气泡，再次注入溶液，直到注满为止； ②氢氧化钙组：将齿科用氢氧化钙粉末与溶液调制成糊状，用螺旋输送器导满根管； ③空白对照组：干燥根管后，根管内未封药物，直接充填。

每颗牙齿根管封药后使用Fuji玻璃离子垫底，3M Z350树脂封闭开髓孔。

1.5 拍摄术后CBCT

根管封药4 周后，全麻后拍摄CBCT，使用软件Mimics 21进行牙齿及根尖周透射影的三维重建，测量根尖周牙槽骨破坏体积。

1.6 Real-time PCR检测IL-6的表达

拍摄完成CBCT后将动物处死,拔除实验牙后用挖匙刮取牙槽窝内的根尖周组织,利用总RNA提取试剂盒提取根尖周组织中的总RNA，采用cDNA合成试剂盒合成cDNA，反应在Real-time PCR检测仪(罗氏LC96)上进行，内参基因磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)及IL-6引物序列见表1。反应条件为：94 ℃预变性30 s，94 ℃变性5 s，62 ℃退火35 s，共40 个循环，溶解曲线97 ℃10 s， 65 ℃ 60 s， 97 ℃1 s。PCR扩增后，实时荧光定量PCR仪自动分析结果，根据阴性对照调整阈值和基线以确定各个标本的Ct值，并根据熔解曲线确定该Ct值是否有效。将结果导出，采用2-ΔΔCT法分析目的基因在对照组和各测定组之间的表达差异，计算公式如下： ΔCt=Ct目的基因-Ct内参， 再求得对照组ΔCt的平均值，记为ΔCt对照平均，用各组的ΔCt分别减去ΔCt对照平均， 求得ΔΔCt值，即ΔΔCt=ΔCt样本-ΔCt对照平均， 再计算各组2-ΔΔCT值，即为各组中基因的相对表达量。

表1 GAPDH及IL-6引物序列

1.7 统计学分析

2 结 果

2.1 Beagle犬慢性根尖周炎动物模型的构建

将Beagle犬前磨牙开放7 d后封闭开髓孔，经过45 d后，拍摄CBCT，获得DICOM格式的图像数据。利用Mimics重建CBCT影像，形成牙齿及根尖周组织破坏情况的三维影像(图1)，可见犬前磨牙均出现根尖周组织破坏，成功构建Beagle犬慢性根尖周炎动物模型。

图1 Beagle犬慢性根尖周炎模型三维重建图

2.2 根管封药4周后各组根尖周组织破坏区的重建及其比较

根管封药 4周后，再次拍摄CBCT，利用Mimics重建CBCT影像，形成牙齿及根尖周组织破坏情况的三维影像(图2)。

图2 根管预备并封药前后对比根尖周组织破坏三维重建图

根管封药4 周后，再次拍摄CBCT，利用Mimics重建CBCT影像，形成牙齿及根尖周组织破坏情况的三维影像。利用Mimics软件测量各牙齿根尖周破坏的体积(表2)。结果显示：根管预备后，各组封入不同根管封药，其根尖周破坏的体积都较术前缩小；0.1%纳米银溶液组根管封药后根尖周阴影的体积与术前相比，具有显著性差异(P<0.01)，氢氧化钙组根管封药后与术前相比，差异具有统计学意义(P<0.05)，而空白对照组术前与术后相比，差异无统计学意义(P>0.05)。

表2 根尖周破坏体积术前术后的比较

Tab 2 Comparison of the lesion volume before and after intracanal medicament (n=20, mm3)

表2 根尖周破坏体积术前术后的比较

组 别术前术后t值P值0.1%纳米银11.80±5.00 6.11±2.57 4.5280.000氢氧化钙11.20±4.09 8.55±4.06 2.0560.047空白组10.68±3.72 7.78±2.34 2.9490.050

2.3 Beagle犬慢性根尖周炎动物模型根尖周IL-6 mRNA的表达

0.1%纳米银溶液组、氢氧化钙组、空白对照组根尖周组织中IL-6 mRNA相对表达量分别为0.009(0.005,0.08)、0.324(0.06,0.794)、0.011(0.004, 0.054)(表3)，不同组间IL-6 mRNA相对表达量的差异无统计学意义(P>0.05)。

表3 根尖周组织IL-6 mRNA表达量的比较 (n=10)

3 讨 论

尽管根管治疗术是目前治疗牙髓病和根尖周病最有效的方法，但由于根管系统的解剖复杂性，机械预备和化学预备无法达到所有侧副根管和细小弯曲根管等部位，影响了根管治疗的成功率。研究表明，细菌能以生物膜的形式生存于低氧张力和低营养环境中并附着在根管峡部和牙本质小管内以及其他结构表面[12]。为提高根管治疗的成功率，应杀灭这些生物膜细菌，目前最常用的根管消毒药物为氢氧化钙。然而，也有学者研究认为其抑菌深度和抑菌效果较差[3]。因此，寻找安全、高效的根管消毒药物是牙髓病学者们提高根管治疗成功率的重要途径。

氢氧化钙是目前最常用的根管内消毒药物，其具有很强的抗菌活性、能够灭活残留在根管壁上的细菌内毒素、通过促进碱性磷酸酶活性和矿化组织形成有利于根尖周组织的修复。本实验中，成功构建了Beagle犬慢性根尖周炎动物模型，为进一步研究根管内封药提供了动物模型。实验中，氢氧化钙封药组的根尖周阴影体积较术前缩小，差异有统计学意义，这充分说明氢氧化钙有促进根尖周病变愈合的作用。感染根管经过机械和化学预备后需要根管封药以进一步消除残留细菌和毒素，而在根管充填前应彻底清除这些封药，否则会降低根管封闭剂向牙本质小管渗透，影响其封闭效果，增加了根尖渗漏的风险。Laky等[4]研究了光子诱导光声流技术(photon-induced photo- acoustic streaming，PIPS)去除根管内氢氧化钙的效果，结果表明PIPS对根管内氢氧化钙的清除效果非常明显，较其它方法具有不可比拟的优点。但是由于PIPS技术需要专门的激光设备，因此限制了其临床应用。

为了进一步寻找安全、高效的根管消毒封药，在本实验中进一步探讨了0.1%纳米银溶液用于犬慢性根尖周炎动物模型根管封药的作用。纳米银具有表面效应、小尺寸效应和宏观隧道效应等特性，还具有超强的抑菌杀菌能力，被广泛地应用于医药领域。研究表明，纳米银浓度越高，其抑菌效果越明显，相对细胞毒性就越高[13]。Holla等[14]发现纳米银溶液对变形链球菌的最低抑菌浓度(MIC)为40 μg/ml；张富强等[15]发现浓度在25 g/L以下的纳米银粒子没有细胞毒性。董立民等[16]发现对粪肠球菌的MIC为37.5～75 μmol/L，而对链球菌MIC为18.75～37.5 μmol/L。张富华等[17]发现0.1%的纳米银溶液抑菌效果高于2%的次氯酸钠溶液，Samiei等[18]应用纳米银凝胶用于抑制牙本质小管内的粪肠球菌，由于其流动性受限制，纳米银凝胶的抑菌效果并不突出；刘奕等[19]发现载银纳米羟磷灰石抑制粪肠球菌的作用较好。虽然有很多的学者研究了纳米银的体内残留及累积问题，但目前还没有学者对纳米银制剂载体在根管内的可能残留问题及影响根管充填严密性的研究，所以本实验采用了0.1%浓度(100 μmol/L)的纳米银溶液，结果表明，封药后根尖周破坏体积明显缩小(P<0.01)，促进了根尖周病变的愈合。通过本研究证明，0.1%纳米银溶液进行根管消毒封药，不仅能够达到根管内消毒的作用，而且由于自身是液体，能够容易去除，从而避免氢氧化钙根管封药后难以清除的缺点。

IL-6和TNF-α是引起根尖周骨质破坏的重要炎症因子，IL-6通常被推荐用来检测慢性根尖周炎的炎症程度[20]，而且杨文东等[21]的研究表明IL-6 mRNA的表达水平与病体积损关系不大。纳米银制剂的抑菌效果明显，其生物毒性一直是制约其广泛使用的关键因素。通过本研究证明0.1%纳米银溶液组根尖周组织中的IL-6 mRNA的相对表达量与氢氧化钙糊剂及空白对照组相比，无统计学差异(P>0.05)，说明0.1%纳米银溶液对根尖周组织的炎症刺激性不明显。总之，0.1%纳米银溶液与氢氧化钙相比，能有效促进犬慢性根尖周炎根尖周组织的愈合，且对根尖周组织无明显炎症刺激作用。本实验的局限性在于仅探讨了根管预备后0.1%纳米银溶液和氢氧化钙封药效果的比较，并不能代表整个根管治疗过程。在后期的实验中应该进一步探寻纳米银应用的最佳浓度、最佳粒径，使其发挥最佳抑菌和杀菌效果，为在临床中应用于根管消毒封药提供理论依据。