雪旺细胞对种植体周围组织修复的实验研究

王艳玲 丁虹 何巍 朱兰省 刘爱群 许小婷

牙科种植术治疗后，在术后早期或是在中晚期愈合过程中，炎症反应的强弱和持续时间直接影响周围组织的愈合效果[1]。术后龈沟液中炎症因子、趋化因子、粘附分子的含量反映出牙周局部的炎症反应的强弱程度，而持续的炎症反应则是导致骨质吸收和种植体不稳的病理基础[2]。同熔附金属全冠对种植体周围织中炎症因子和黏附分子表达的影响抑制种植体术后感染和炎症反应成为种植体术后的关键治疗措施。雪旺细胞是周围神经系统轴突髓鞘细胞，不但可以保护神经轴突，而且可以分泌多种神经营养因子，吞噬细胞碎片，调节损伤处的炎症反应，具有十分重要的细胞移植潜能[34]。本研究以成年比格犬为动物模型，研究雪旺细胞移植对种植体植入术后周围软组织炎症反应的抑制作用。

1 材料与方法

1.1 伦理学声明

本研究所以实验操作由河南省中医院伦理委员会批准，所有实验步骤遵循ARRIVE 指南(http://www.nc3rs.org.uk/ARRIVE)和美国国立卫生院动物实验指南(NIH Publications no. 85-23, revised 1996)。

1.2 雪旺细胞的提取和培养

无菌条件下，肌肉注射1 ml/kg浓度为30 g/L的戊巴比妥钠溶液，全麻下，在犬的大腿内侧做纵形切口至皮下，并分离肌层至暴露坐骨神经，游离并切取长约4 cm左右的神经束，并做好标记；将所取神经束立即置入4℃的生理盐水中清洗，显微镜下剥离粘连组织，将神经纤维剪成碎块；使用胶原酶液(0.03%)和胰蛋白酶液(0.25%)混合均匀(比例1∶2)在37 ℃水浴中消化神经组织碎块，约20 min后加入血清培养基以终止其消化； 3 min后进行离心(1 000 r/min)约5 min，去上清； 加入DMEM培养基(10%胎牛血清)反复吹打细胞及组织块至均匀；植于培养皿(均含多聚赖氨酸)中加入适量培养基, 置入37 ℃培养箱(5%CO2)中进行培养； 24 h后加入阿糖胞苷(5 μmol/L)，再次培养24 h后，更换新鲜DMEM培养液(含10%胎牛血清，0.1%的青霉素及链霉素、20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子)继续培养并传代备用。

雪旺细胞培养基于传代第二次前收集， 1 000 r/min离心10 min后清除细胞碎片，收取上层上清培养基，用于培养神经元。

1.3 动物造模

自体坐骨神经切除术同期拔出两侧下颌后牙，术后给予常规抗感染治疗，常规半流质饮食1 周。 2 月后待牙槽骨状态平稳时，用经喷砂处理的Straumann种植体(瑞士)12 颗， 规格：3.3 mm(直径)×10 mm(高)，RN(Regular Neck，常规颈)，SP(Standard Plus，美学种植体)。全麻下，同期分别在6 只实验犬的下颌骨左、右两侧各植入种植体两颗，共计12 颗种植体，并在每只实验犬的右侧下颌骨的种植窝内均匀浓度为1×105/ml的预先从自身坐骨神经中提取并经过纯化、培养且具有生物活性的雪旺细胞0.2 ml，左侧种植体则作为对照组，常规种植体植入，加入0.2 ml PBS最为对照。术后抗感染治疗，常规半流质饲养。

1.4 雪旺细胞鉴定

比格犬自体坐骨神经雪旺细胞经过培养和纯化后，铺于培养板中进行免疫细胞荧光染色鉴定从而判断所提取雪旺细胞纯度是否符合移植条件，培养板中雪旺细胞经过无菌PBS液反复洗涤细胞3 次，低温40 g/L多聚甲醛，置于0～4 ℃冰箱中固定约10 min，无菌PBS液再次洗涤细胞3 次；加入1% Triton-100溶液后放入37 ℃恒温箱中20 min，PBS液再次洗涤细胞3 次，于培养板中加入血清封闭液，放入37 ℃恒温箱封闭5 min，PBS液洗涤细胞1 次后；加入S100抗体(1 ∶ 200,兔抗犬)，在4 ℃冰箱中孵育一抗24 h；PBS液洗涤细胞3 次，加入荧光二抗(Alexa FluorTM594标记，羊抗兔)，常温避光孵育二抗30 min后加入PBS液洗涤3 次；荧光显微镜下观察，荧光显微镜下观察，胞浆呈红色荧光者即为雪旺细胞。

1.5 龈沟液收集

在雪旺细胞移植后1 月，收集左右两侧种植体周围的龈沟液。将滤纸裁剪成1 mm×10 mm长方形，收集每只种植体与牙周组织间隙前后左右4 个采集位置的龈沟液，每条滤纸放置时间20 s，充分吸收龈沟液后称重并使用酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒检测肿瘤坏死因子(TNF-α)、白介素1-β(IL-1β)和白介素-6(IL-6) 3 种炎症因子的蛋白表达量。

1.6 酶联免疫吸附试验(ELISA)检测炎症因子

将收集到比格犬种植体龈沟液的滤纸条加入500 μl平衡盐溶液，充分混匀溶解吸附于滤纸条的龈沟液， 1 000 r/min离心后取样本进行蛋白定量，使用ELISA试剂盒(Elabscience®，武汉伊莱瑞特)检测TNF-α、IL-1β和IL-6 3 种炎症因子的蛋白表达情况，实验方法按照商家说明书严格操作。

1.7 神经元培养

取出生1～2 d Wistar大鼠2 只，冷盐水条件下使用体式显微镜分离大脑组织，完整剥离脑膜后在冷DMEM/HG条件下剪碎大脑组织，而后使用木瓜蛋白酶和胶原酶消化大脑组织(37 ℃/30 min)，消化完全后1 000 r/min, 离心5 min，使用培养基重悬细胞，按照1.5×105个细胞/ml密度铺于24 孔培养板中。4 h后更换培养基。24 h后加入雪旺细胞培养基上清，对照组加入生理盐水。继续培养3 d后使用细胞免疫荧光观察神经元轴突长度。

1.8 免疫组织化学染色

麻醉满意后，切取种植体周围牙龈(3 mm×3 mm)，进行NF-200(ABCAM，美国)免疫组织化学染色，显微镜下比较2 组间NF-200阳性神经纤维表达。

1.9 统计学分析

2 结 果

2.1 雪旺细胞鉴定及种植体雪旺细胞共移植

比格犬自体坐骨神经切除后提取雪旺细胞，所提取雪旺细胞经过体外传代、纯化后进行免疫细胞荧光S-100染色鉴定。所培养比格犬自体坐骨雪旺细胞，为梭状，细胞胞体透亮，细胞群呈螺旋形排列，免疫细胞荧光S-100染色呈现红色荧光，纯度较高(图1A)，可以达到细胞移植标准并且进行细胞移植种植体共移植(图1B)。

A： 雪旺细胞(S-100)免疫荧光染色(×100)；B： 种植体植入

2.2 雪旺细胞移植促进神经元轴突生长

对照组按照1∶1加入新鲜雪旺细胞培养基，雪旺细胞培养基组加入雪旺细胞后收取的培养基。培养3 d后NF-200细胞免疫荧光检测神经元轴突长度。结果显示雪旺细胞培养基组神经元轴突长度显著优于对照组(t=4.72，P<0.05)(图2)。

A：对照组； B： 雪旺细胞培养基组； C: 神经元轴突长度

2.3 龈沟液炎症因子与营养因子表达

在比格犬下颌后牙拔出2 月后行种植体植入术，在植入种植体同时在右侧2 颗种植体移植部位移植雪旺细胞，对照侧加入相同体积的PBS盐溶液，在雪旺细胞移植后1 月检测左右两侧种植体龈沟液中TNF-α、IL-1β和IL-6 3 种炎症因子及BDNF和NGF表达含量。与对照组相比，雪旺细胞移植组TNF-α、IL-1β和IL-6 3 种炎症因子蛋白表达水平均显著下降(P<0.05)(图3A)，BDNF和NGF的表达量显著升高(P<0.05)(图3B)。

图3 龈沟液中炎症因子及营养因子表达量

2.4 雪旺细胞移植后促生牙龈神经纤维生长

在比格犬下颌后牙拔出2 月后行种植体植入术，在植入种植体同时在右侧2 颗种植体移植部位移植雪旺细胞，对照侧加入相同体积的PBS盐溶液，1 月后使用NF-200免疫组织化学检测左右两侧种植体周围牙龈组织神经纤维数量。与对照组相比，雪旺细胞移植组表达更多NF-200阳性神经纤维(图4)。

图4 牙龈神经纤维NF-200免疫组织化学染色 (×100)

3 讨 论

种植体周围炎症可累及牙周软组织以及牙周硬组织，使种植体周围组织退化而最终导致种植体不稳及脱落。炎症因子的大量产生引起种植体周围局部炎症反应加重，种植体周围炎症反应是导致种植体周围软组织退变、牙槽骨骨质吸收、破坏的主要因素之一[5]。TNF-α、IL-1β和IL-6是最常见的炎症因子[6]。IL-6作为炎症细胞趋化因子，可以趋化中性粒细胞、巨噬细胞及淋巴细胞进入种植体周围软组织， 浸润到种植体周围的炎症细胞继续分泌TNF-α、IL-1β和IL-6，进一步趋化炎症细胞浸润和释放大量炎症因子而加重局部炎症反应，导致炎症瀑布反应，龈沟液中的炎症因子表达含量和牙周袋深度及附着能力丧失直接相关，随着牙周软组织退化，牙槽骨组织也发生破坏，最终导致种植体的不稳、甚至是脱落[7]。TNF-α不但可以作为评价局部炎症反应强度的指示因子，而且其可以促进破骨细胞的成熟和分化，同时抑制成骨细胞的形成和分化，最终导致种植体周围牙槽骨骨质流失[8-9]。IL-1β可以激活破骨细胞，增加局部牙槽骨骨质流失[10]。同时IL-1β也可以作为临床监测种植体周围骨质吸收程度的重要评价指标[11]。抑制上述3 种炎症因子的表达对于减轻种植体周围炎症反应具有十分重要的作用，从而可以减轻种植体周围软、硬组织的退化和吸收，减少种植体的不稳和脱落。

当牙齿拔除后，牙周膜组织完整性遭到损伤，其内部的神经纤维破坏，致使骨感知能力下降。雪旺细胞作为周围神经系统的主要胶质细胞，起源于胚胎时期的神经嵴，具有形成周围神经轴突髓鞘、分泌神经营养因子(BDNF和NGF)及调节炎症反应的作用[12-14]，在组织工程研究中也起着举足轻重的作用，被称作人工神经再生的种子细胞。现今，被证实的主要作用有：激活巨噬细胞清除坏死崩解物；调节损伤局部的炎症反应，减轻组织损伤；迅速增殖、分泌营养因子、形成髓鞘，引导轴突再生与生长，为神经再生提供环境等[14-16]。NGF是促进神经元生长的重要神经营养因子，除在神经系统中作用外，也可以调节种植体植入后成骨细胞活化、分化、矿化及周围神经、血管形成，从而促进种植体骨结合[17]。改善种植体周围微环境对于减少种植体周围软组织退变和骨质吸收具有十分重要的作用。雪旺细胞体现出良好的调节种植体周围炎症的功能，同时其促进神经元轴突生长的作用可以改善骨感知，促进种植体骨结合。

本研究结果显示比格犬自体坐骨神经雪旺细胞培养纯化后纯度高，达到进行细胞移植治疗的要求。在植入种植体1月后，雪旺细胞共移植组TNF-α、IL-1β和IL-6的蛋白表达水平相比对照组显著下降(P<0.05)，雪旺细胞显示出在调节种植体周围炎症反应中的良好作用，对于减轻种植体软、硬组织退化及吸收具有治疗潜能，同时具有应用于临床中的巨大潜力，但是仍然需要进一步研究证实在人体的治疗效果，为雪旺细胞移植调节种植体周围炎症铺平道路。