副鸡禽杆菌外膜蛋白抗体间接ELISA检测方法的建立

梅 晨，李淑芳，黄明明，孙爱华，龚玉梅，王宏俊

(北京市农林科学院畜牧兽医研究所 畜禽疫病防控技术北京市重点实验室，北京海淀100097)

副鸡禽杆菌(Apg)是鸡传染性鼻炎(IC)的致病菌，可以引起鸡打喷嚏、流出稀薄水样鼻涕，之后出现眼结膜和面部肿胀，甚至上下眼皮粘合在一起等症状。病鸡消瘦，下痢，产蛋鸡产蛋量急剧下降，可达40%[1]。该病常与鸡毒支原体[2]、大肠杆菌等混合感染，引起更为严重的损失。仅凭临床症状难以做出准确诊断，建立快速准确的诊断方法是副鸡禽杆菌病防控的前提，血清抗体监测对鸡传染性鼻炎的有效防治非常必要。

Page等人通过血凝抑制(HI)方法将Apg分类为A、B和C型3种型，并且发现3种血清型之间没有交叉保护[3]。Takagi M等人报道了利用型特异性单克隆抗体的竞争ELISA，以此代替HI试验的血清学诊断法[4-5]。该方法灵敏度高，具有一次处理多个样本的优点。但是，采用该方法需要确保型特异性单克隆抗体、血清样本中的抗体都可以和同一个表位结合，由于菌体的变异而失去该表位时，则无法检测菌体感染或疫苗接种所产生的抗体，该方法易出现假阴性结果。上述血清型检测方法还不能用于免疫效果监测。

有文献显示，副鸡禽杆菌外膜蛋白HMTp210的部分片段非常保守，不同血清型间同源性很高，本研究在筛选鉴定副鸡禽杆菌的外膜蛋白[6]的基础上，利用其具有保守性抗原的特性，包被酶标板并建立间接ELISA检测方法，该方法能够检出针对Apg的A型菌、B型菌和C型菌的鸡血清抗体。对评价疫苗免疫效果及鸡只对副鸡禽杆菌的防疫水平具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 菌株及血清 副鸡禽杆菌A、B、C三个血清型的标准株由本实验室保存。Apg的A型菌、B型菌和C型单因子鸡血清和P9蛋白抗血清分别由对应菌株或抗原人工接种SPF鸡制得，由本实验室制备并保存。大肠杆菌O1、O2、O78亚型以及禽流感(AI)H9亚型、新城疫(ND)LaSota株(NDLa)和F48株(NDf48)、鸡传染性法氏囊病(IBD)、减蛋综合征(EDS’76)等禽病病原单因子阳性鸡血清及SPF鸡血清等，均由本实验室保存或制备，支原体抗MG-S6 株阳性血清购自中国兽医药品监察所。120份临床样本血清采自河北某蛋鸡场120日龄鸡，该鸡群分别在56日龄和90日龄用鸡传染性鼻炎三价灭活疫苗进行了免疫。

红细胞凝集反应用抗原(HA抗原): 副鸡禽杆菌A型(Hp8株)、B型(BJ株)和 C型(668株)HA抗原，HA效价均为1∶160；副鸡禽杆菌A型阳性血清、B型阳性血清和C型阳性血清, 红细胞凝集抑制(HI)抗体价为1∶80 ～ 1∶160；10%戊二醛固定的鸡醛化红细胞，以及血清稀释液(含0.1% BSA的0.01 mol/L pH值7.0 PBS)，以上材料均由本实验室制备并保存。

1.2 主要试剂和仪器 酶标板为NUNC 公司产品，HRP 标记兔抗鸡IgG抗体产自Sigma公司;TMB 显色液产自KPL 公司;酶标仪(Molecular Devices，SPECTRA MAX190)。

1.3 方法

1.3.1 抗原蛋白P9的制备及纯化 利用生物信息学软件Geneious(Biomatters. Ltd，网址http://www.geneious.com/)，通过对副鸡禽杆菌外膜蛋白HMTp210的基因(GenBank No. KJ867497)筛选分析，选取氨基酸序列从第1090到1648的肽段，命名为P9，由华大基因科技(北京)服务有限公司进行全基因合成并原核表达。通过对P9编码基因的PCR扩增、与表达载体pET30a连接等步骤构建重组表达质粒pET30a-P9。将pET30a-P9转化BL21(DE3)，诱导表达后超声裂解上清用镍亲和层析柱纯化，获得纯化的P9蛋白。

1.3.2 阴性血清及P9蛋白抗血清的制备 重组抗原蛋白P9与MONTANIDE ISA 71 VG佐剂(SEPPIC公司产品)按3∶7重量比混合乳化(操作方法见SEPPIC公司产品使用方法介绍)，使疫苗中抗原蛋白终浓度为20 μg/mL，所制备的疫苗命名为vP9。免疫方法：取42日龄SPF鸡，分为2组，30只/组。其中一组为疫苗免疫组，分别胸部注射所述vP9疫苗0.5 mL/只；另一组为非免疫对照组。第1次免疫后间隔4周，对所有免疫组的鸡进行二次免疫，剂量及免疫途径与首次免疫相同。所有试验鸡每周于翅静脉采血1次，分离血清，-20 ℃保存备用。

1.3.3 间接ELISA方法的建立

1.3.3.1 抗原包被浓度及血清稀释度的选择 采用棋盘滴定法，用0.05 mol/L 碳酸盐缓冲液(PBS,pH值9.6)依次按以下比例稀释P9抗原(0.5 mg/mL)：依次做50、100、500、1 000、2 000、4 000、8 000、16 000倍稀释，包被反应板100 μL/孔，横向包被酶标板，4 ℃过夜；PBST(PBS+1%tween20,pH值7.4)清洗3遍后加入封闭液(5%脱脂乳，PBS配制)，37 ℃封闭2 h，PBST清洗3遍。阳性血清及阴性血清分别用稀释液(1%脱脂乳，PBS配制)从1∶50进行倍比稀释(1∶50 ～ 1∶400)，100 μL/孔，纵向加入封闭后的抗原包被板中，其余试验步骤均按ELISA方法进行，试验结果标准副鸡禽杆菌阳性血清值OD450 nm值为1.0左右，阴性OD450 nm值设为0.1左右的范围选择P/N值最大为最佳稀释条件。

1.3.3.2 最佳血清抗体孵育时间筛选 将血清用稀释液稀释至相应浓度后加入抗原包被板，100 μL/孔，分别37 ℃孵育0.5 h、1 h、2 h，其余试验步骤均按ELISA方法进行，试验结果选择P/N 值最大为最佳孵育时间。

1.3.3.3 酶标二抗最佳工作浓度及时间确定 完成血清孵育并清洗后，以稀释液分别稀释HRP 标记兔抗鸡IgG抗体至1∶5 000、1∶10 000、1∶20 000，100 μL/孔，分别37 ℃孵育0.5 h、1 h，其余试验步骤均按ELISA方法进行，试验结果选择P/N值最大为最佳条件。

1.3.3.4 显色时间确定 酶标二抗孵育结束并清洗后，加入TMB显色液，100 μL/孔，放置于37 ℃孵育5、10、15、20 min后加入2 mol/L H2SO4终止读数，50 μL/孔。选择P/N值最大时最佳显色时间。

1.3.4 临界值的确定 在优化间接ELISA的最佳条件后，使用该方法对30份阴性血清进行检测，根据检测样品的OD450 nm值平均值和标准差设定该间接ELISA方法的判定值：X+3 s；待检样品的OD450 nm值若大于判定值，则该样品为阳性，反之，则判为阴性。

1.3.5 交叉反应性试验 采用标记为Hp8(A型)、0221(A型)、0083(A型)、0222(B型)、BJ(B型)、668(C型)、Modesto(C型)等不同血清型副鸡禽杆菌分别单独感染的鸡血清作为待测阳性血清，未经免疫的SPF鸡血清为阴性血清，各个血清样本做3个平行重复测试，用于评价本方法的交叉反应性。

1.3.6 特异性检验 应用已建立的间接ELISA方法，对常见的大肠杆菌O1、O2、O78株，禽流感(AI) H9亚型、新城疫(ND)LaSota株(NDla)和F48株(NDf48)、减蛋综合征(EDS’76)、鸡毒支原体MG-S6等禽病病原的阳性血清进行检测，并以标准副鸡禽杆菌阳性血清为阳性对照，测定OD450 nm值，各个血清样本做3个平行重复测试，确定该方法的特异性。

1.3.7 ELISA方法检测田间血清样品 本试验建立的ELISA方法，对所收集的临床免疫鸡血清，进行测定。各个血清样本做3个平行重复，计算OD值，并依照本试验所设标准判定检测结果。

1.3.8 ELISA方法与HI试验 实验室收集的120份临床样品用HI试验进行对比试验，分别用3个血清型的HA抗原进行检测，方法如下[7]：用血清稀释液将吸附后的血清作2倍系列稀释,第1孔为1∶5，第2孔为1∶10, 依此类推,共作8个稀释度(1∶5,1∶10,1∶20，…，1∶640)，每孔含有50 μL稀释血清。在各管中加入4个HA单位的HA抗原50 μL, 充分混匀后在室温作用20 min,然后每管加入1%鸡红细胞50 μL, 充分混匀后在室温静置60 min, 判定结果, 以完全抑制HA的血清最高稀释度为血清的HI效价。若试验血清的HI效价≥5,即判为阳性。

2 结果

2.1 抗原蛋白P9的制备及纯化 本试验成功构建重组质粒，并将其诱导表达后超声裂解，如图1所示，诱导后重组菌大量表达P9蛋白，且P9蛋白大部分存在于裂解后的上清中。如图2所示，经镍柱纯化后，获得纯度较高的蛋白P9，纯度80%。

图1 P9重组菌株蛋白表达图

M：Marker ; 1：重组菌诱导后裂解沉淀 ; 2：重组菌 诱导后裂解上清 ; 3：诱导前重组菌

图2 P9蛋白纯化

M：Marker；1：P9蛋白纯化后

2.2 间接ELISA方法建立 经棋盘滴定，结果表明,当血清最佳稀释度为1∶100，包被抗原的浓度为1 μg/mL时P/N值最高；以5 %脱脂奶为稀释液稀释血清后加入孔内反应60 min时P/N值为最高，以此确定血清样品孵育时间为60 min；以1 %脱脂奶为稀释液稀释酶标二抗的最佳反应时间为30 min，稀释比例为1∶10 000；底物显色时间为15 min。

2.3 ELISA判定值的确定 对30份阴性的鸡血清进行ELISA方法检测，测得阴性血清的平均OD值为0.097，标准差为0.066，因此ELISA方法的判定值为0.295。当样品OD值≥0.295时，判定为阳性。为便于判断，设定OD450值=0.3为本方法的阳性临界值。

2.4 ELISA方法的交叉反应性结果 使用本试验建立的间接 ELISA 方法分别检测SPF鸡阴性血清、Hp8、0221、0083、0222、BJ、668、Modesto等副鸡禽杆菌菌株的阳性鸡血清，试验结果表明，该方法能够检出针对不同血清型的副鸡禽杆菌阳性血清，具有较好的交叉反应性。如图3所示。

图3 重组P9蛋白的交叉反应性

2.5 ELISA方法的特异性试验结果 经测定，本文所建立的ELISA方法检测大肠杆菌O1、O2、O78；AI、NDf48、NDla、EDS′ 76、MG-S6等病原体的特异性阳性血清，OD450值均小于0.1，为阴性(图4)。表明本文所建立的ELISA方法具有较好的特异性。

图4 ELISA方法的特异性试验

2.6 临床样品的检测结果 ELISA结果显示，本方法测得的田间血清样品120份均为阳性，OD450值均大于0.3，平均约为0.45，说明所建立的ELISA方法可以用来检测鸡传染性鼻炎疫苗免疫后的抗体水平。

HI试验检测同批样品，针对A型、B型和C型的HA抗原，分别有98份、80份和85份样品显示为阳性，其中65份样品HI检测结果为A、B、C全部阳性，阳性样品HI滴度为1∶5～1∶20之间。其余样品呈现A型、B型或C型部分阴性，或全部是阴性的结果。

3 讨论

目前对鸡传染性鼻炎病原的检测常用PCR法[8-9]、血清抗体检测方法常用血凝抑制(HI)方法和单克隆抗体的竞争ELISA等方法，实际应用中都存在一定局限性[10-12]。

血凝素是副鸡禽杆菌的一种抗原蛋白成分，处理或不经过处理的副鸡禽杆菌具有凝集鸡红细胞的能力。因此，实践中利用HI试验对副鸡禽杆菌进行分型和测定抗体水平。近年来的研究发现，HI抗体水平与鸡群免疫保护率没有直接的相关性。换言之，血凝素可能并非副鸡禽杆菌的保护性抗原核心成分。和众多革兰阴性致病菌类似，外膜蛋白可能是副鸡禽杆菌的关键性抗原成分，本研究开展了外膜蛋白在免疫及抗体检测方面的研究。

HMTp210是副鸡禽杆菌的一个外膜蛋白，其中含有高变区Region 2，血清型间同源性只有40%或更低，Region1和Region 3同源性则高达98%以上[13-14]，本研究中选取的P9蛋白位于Region 2和Region 3之间，是血清型间较为保守的片段，同时具有很好的免疫原性，免疫后可以产生较高的血清抗体效价，便于检测。

本试验使用纯化的外膜蛋白作为抗原，该方法用一种抗原蛋白可实现对Apg的A型菌、B型菌以及C型菌3种血清型抗体的检测，不必采用对应血清型的抗原，简化了抗体检测步骤。与以往的菌体破碎物包被方法相比[15]，包被抗原纯度高。重组外膜蛋白可以与不同血清型副鸡禽杆菌单因子阳性血清发生反应，而与其他常见病原的阳性血清，如大肠杆菌O1、O2、O78；H9亚型禽流感、新城疫、减蛋综合征、鸡传染性囊病、鸡毒支原体等没有交叉反应，该检测方法特异性优于全菌抗原包被的ELISA方法。

同时，由于P9外膜蛋白可以交叉检测出A、B、C三型副鸡禽杆菌的血清抗体，该蛋白也可能用作亚单位疫苗的候选抗原，我们将在可行性方面做进一步探讨。