枯草芽孢杆菌对镉暴露鲫鱼镉代谢及抗氧化的影响

王云翔，尹玉伟，尹玉林，程 义，秦 悦，王 楠，李月红

(吉林农业大学动物科学技术学院，吉林长春130118)

镉(Cadmium, Cd)是一种对动植物危害巨大的重金属，被广泛的应用于电池、电镀、颜料等众多制造环节。镉是生命过程的非必需元素，因此镉进入动植物机体后会造成严重的损伤[1]。我国《渔业水质标准》(GB11607-89)规定水中镉浓度需低于0.005 mg/L[2]。

镉中毒的治疗主要是通过使用螯合剂，而螯合剂较大的副作用，使其使用受到较大的限制[3]。益生菌具有较高的抗逆性以及重金属耐受性，其对动物重金属中毒有一定缓解作用[4]。研究表明，乳酸菌具有较好的耐重金属(主要是镉和铅)作用，同时对于动物的急性或慢性镉中毒都能够有一定缓解作用[5-6]。枯草芽孢杆菌被广泛应用于畜牧养殖中，而其对于重金属减毒作用研究较少，对于镉毒性缓解作用研究更少。本试验将枯草芽孢杆菌和不同剂量的镉分别加入饲料和水中暴露鲫鱼，测定组织中镉浓度及抗氧化指标，为枯草芽孢杆菌减镉毒性提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康鲫鱼300条，平均体重55 g±0.74 g，由新立城水库提供。试验前置于80 L玻璃缸中适应7 d。

1.2 主要试剂和仪器

1.2.1 主要试剂 氯化镉(CdCl2·2.5 H2O )、高氯酸、硝酸和氯化钠，购自北京化工厂； 琼脂、酵母提取物和胰蛋白胨，购自北京索莱宝科技有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽巯基转移酶(GST)和谷胱甘肽(GSH)试剂盒，均购自南京建成生物有限公司。

1.2.2 主要仪器 全波长酶标仪，赛默飞世尔科技有限公司；火焰原子吸收分光光度计，日本岛津公司；低温高速离心机，贝克曼库尔特公司。

1.2.3 镉溶液的配制 镉母液配制：称取20.31 g氯化镉，充分溶于1 L的蒸馏水中，转至玻璃瓶中保存备用。

1.3 试验设计

1.3.1 枯草芽孢杆菌耐镉试验 配制含有梯度镉(100 mg/L～700 mg/L)的LB培养板，将枯草芽孢杆菌涂于培养板上，进行最大耐镉浓度测定。将6.4×109CFU/mL的液体LB稀释后涂于梯度镉板上，培养12 h观察枯草芽孢杆菌的生长情况。

1.3.2 动物试验 经适应7 d的鲫鱼，随机分成6组，对照组(C0S0)，枯草芽孢杆菌组(C0S1)：饲料中只添加108CFU/g的枯草芽孢杆菌；低浓度镉组(C1S0)：在水中只添加0.5 mg/L的镉；枯草芽孢杆菌治疗1组(C1S1)：饲料中添加108CFU/g的枯草芽孢杆菌和在水中添加0.5 mg/L的镉；高浓度镉组(C2S1)：在水中只添加1 mg/L的镉；枯草芽孢杆菌治疗2组(C2S1)：饲料中添加108CFU/g的枯草芽孢杆菌和在水中添加1 mg/L的镉。试验期间，每天9点和18点饲喂2次，饲喂量为鱼体重的1%～2%，每缸水为80 L，每2 d换水1次，换水量为总体积的1/3，水温维持在23 ℃±2 ℃，水中的溶氧为7.2 mg/L，试验周期为60 d。

1.4 测定指标以及方法

1.4.1 样品采集 试验结束后，进行组织样品的采集，分别采取鲫鱼的鳃、肝脏、胰脏、肠道、肾、脾脏和肌肉组织。采样前先用麻醉剂将鲫鱼进行麻醉，放于冰袋上进行解剖，采集后的组织用无菌生理盐水进行冲洗，滤纸吸干后放于-80 ℃保存。

1.4.2 组织镉浓度测定 将采集的组织，用双蒸水清洗，55 ℃烘干，称取重量，加浓硝酸进行酸解后使用高压微波炉进行消解，消解后定溶于20 mL的容量瓶中，使用火焰原子吸收分光光度计测定镉浓度，最后计算组织中镉浓度。

1.4.3 组织氧化指标测定 准确称取组织的重量，将组织剪碎后加入一定量冰冷的生理盐水，冰浴匀浆，3 000 r/min(4 ℃)离心10 min，取上清待用。SOD、GSH、GST各指标按照试剂盒说明书进行测定。

1.5 数据分析 试验结果采用SPSS20.0软件进行处理，组间采用单因素方差分析，两两对比采用LSD分析，以P< 0.05为具有统计学意义。

2 结果

2.1 枯草芽孢杆菌对镉耐性结果 枯草芽孢杆菌对镉耐性结果(图1)，从结果中看出，随着培养基中Cd浓度增加，枯草芽孢杆菌的菌落逐渐变小和变少，当Cd浓度达到300 mg/L时，枯草芽孢杆菌不再生长。

图1 枯草芽孢杆菌对镉耐性结果

A：对照组；B：100 mg/L镉；C：200 mg/L镉；D：300 mg/L镉

2.2 组织中镉浓度测定 由表1可知，组织中镉浓度量大小依次是：鳃>肾>肠>肝>肌肉；同剂量镉暴露组与枯草芽孢杆菌治疗组对比，肝脏、肾、肠和鳃组织中镉含量显著降低(P<0.05)；肌肉组织镉浓度，高浓度镉暴露组与枯草芽孢杆菌治疗组差异显著(P<0.05)。

表1 鲫鱼各组织镉含量

注：同一列数据中，肩标有不同字母者表示差异显著(P<0.05)，肩标有相同字母的表示差异不显著(P>0.05)

2.3 肝脏抗氧化指标测定

2.3.1 肝脏SOD指标 由图2可知，同剂量镉暴露组与枯草芽孢杆菌治疗组对比，肝脏SOD活性显著升高(P<0.05)。

图2 鲫鱼肝脏中SOD变化

2.3.2 肝脏GSH指标 由图3可知，低剂量镉暴露组与枯草芽孢杆菌治疗组对比，肝脏GSH活性显著升高(P<0.05)；高剂量镉暴露组与枯草芽孢杆菌治疗组对比，肝脏GSH活性差异不显著(P>0.05)。

图3 鲫鱼肝脏中GSH变化

2.3.3 肝脏GST指标 由图4可知，同剂量镉暴露组与枯草芽孢杆菌治疗组对比，肝脏GST活性显著降低(P<0.05)。

图4 鲫鱼肝脏中GST变化

3 讨论

枯草芽孢杆菌能够提高畜禽的饲料转化率，改善宿主肠道微生态平衡，提高免疫力，被广泛的应用于畜牧水产中。此外，其还有具有较高的抗逆性，在处理水环境中也具有很广泛的应用，程静等研究发现，在水体中枯草芽孢杆菌对镉最大的耐受为50 mg/L,同时其对水体中的镉具有较高的吸附去除作用[7]。本试验研究发现，枯草芽孢杆菌的最大耐镉浓度在200 mg/L～300 mg/L之间，可能是由于本文所用的菌为鲫鱼养殖池底泥中分离，对镉有较高的耐受性。

镉进入机体后，能够与铁、锌等元素竞争细胞内抗氧化酶的结合位点，导致抗氧化功能的损伤[8]；同时还会破坏硫醇氧化还原平衡，从而导致细胞谷胱甘肽含量降低[9]；上述机制会诱导氧活性自由基(ROS)的过量产生，引起机体的氧化应激反应[10-11]。此外，镉还能够显著刺激金属硫蛋白(MT)的表达，当水生动物暴露重金属后，MT基因在不同组织中的表达与重金属的暴露存在显著的相关性，也因而被用来作为生物标记物来检测水环境中重金属的污染[12-13]。Kim等通过利用维生素C和铅同时暴露许氏平鲇后发现，维生素C能够减少铅的积累，而组织中的铅浓度依次为：肾>肝>脾 >肠>鳃>肌肉。本试验中，组织中镉浓度依次为：鳃>肾>肠>肝>肌肉，这与攻毒方式有关[14-15]，本试验的攻毒方式为将镉加入水中，而Kim是将铅加入饲料中，枯草芽孢杆菌对镉有一定的耐受性，同剂量镉暴露组与枯草芽孢杆菌治疗组对比，肝脏、肾、肠和鳃组织中镉含量显著降低(P<0.05)；肌肉组织镉浓度，高浓度镉暴露组与枯草芽孢杆菌治疗组差异显著(P<0.05)，这可能与枯草芽孢杆菌在鲫鱼肠道内对镉进行吸附，从而降低了肠道内的镉浓度，进而减少了对镉的吸收有关，也可能与枯草芽孢杆菌调节了MT基因的表达有关，具体机制需要进一步研究。组织中镉浓度降低，有利于机体正常代谢的进行，因此，抗氧化指标得到了一定的提升，同时枯草芽孢杆菌的代谢产物能够进入机体，对抗氧化能力也有一定的提升作用。

综上所述，枯草芽孢杆菌具有较高的耐镉能力，同时能够促进镉暴露鲫鱼后组织中镉的代谢速度，此外，对于镉暴露的氧化应激有一定的修复作用。