5 种大肠杆菌O 抗原定型血清的制备

辛凌翔,魏财文,张 媛,李 建,王秀丽,彭国瑞,张一帜,彭小兵,蒋玉文

(中国兽医药品监察所,北京 海淀100081)

大肠杆菌,一方面是人和多种动物肠道中的正常寄居菌,构成肠道正常菌群的组成部分,具有重要的生理作用;另一方面,某些大肠杆菌可构成致病菌,侵入机体后引发相应的感染症,如胃肠道感染、泌尿系统感染、脑膜炎、伤口感染、败血型感染、关节炎等[1]。多项研究表明,致病性的大肠杆菌与其O 抗原密切相关,大肠杆菌的血清分型是以O 抗原为基础的,不同致病性的大肠杆菌在O 抗原血清型上存在明显差异[2-3]。因此,大肠杆菌菌株O 抗原的血清型鉴定对大肠杆菌的病原学研究及流行病学调查等方面具有重要意义。但是,我国现有的大肠杆菌O 抗原定型血清制备工艺较为粗糙,导致实验室血清学鉴定时非特异性交叉凝集素较多,不能保证准确的实验结果,产品质量与生产工艺有待进一步提升与改良[4]。本课题组拟从大肠杆菌O抗原定型血清的制备入手,以期提高此类产品对大肠杆菌血清型鉴定的准确性。

1 材料与方法

1.1 菌株 大肠杆菌参考菌株CVCC1369(O26)、CVCC3800(O153)、CVCC1489(O157)、CVCC3739(O159)、CVCC3807(O163),由中国兽医微生物菌种保藏管理中心提供。

1.2 实验动物 健康家兔,体重1.5~2.0 kg,购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

1.3 培养基及试剂 普通肉汤、普通琼脂、硫乙醇酸盐、酪胨、葡萄糖蛋白胨汤、含0.5%石碳酸生理盐水,购自北京中海动物保健科技公司。大肠杆菌O 抗原定型血清、180 种大肠杆菌菌体微量凝集试验抗原,由中国兽医药品监察所细菌制品检测室提供。

1.4 主要仪器设备 GNP-9270 型隔水式恒温培养箱,购自上海精宏实验设备有限公司。THZ-C 型恒温振荡器,购自太仓市实验设备厂。Herasafe KS 生物安全柜,购自德国Heraeus 公司。离心机购自美国BIO-RAD 公司。

1.5 方法

1.5.1 免疫抗原的制备 将大肠杆菌CVCC1369(O26)、CVCC3800(O153)、CVCC1489(O157)、CVCC3739(O159)、CVCC3807(O163)株冻干菌种接种普通肉汤培养基复壮后,划线接种普通琼脂平皿,37 ℃培养24 h 后,取单菌落接种普通肉汤100 mL,37 ℃200 r/min 培养16 h 后,121 ℃高压1 h,待其恢复室温后,按0.1%加入甲醛溶液,置2 ℃~8 ℃保存备用。

1.5.2 动物的免疫及定型原血清的制备 取20 只健康家兔,每种免疫抗原注射4 只并进行分组编号。1~4 号兔为O26 血清型组,注射大肠杆菌O26 抗原;5~8 号兔为O153 血清型组,注射大肠杆菌O153 抗原;9~12 为O157 血清型组,注射大肠杆菌O157 抗原;13~16 号兔为O159 血清型组,注射大肠杆菌O159 抗原;17~20 号兔为O163 血清型组,注射大肠杆菌O163 抗原。采用兔的耳缘静脉注射法,各组分别免疫抗原共计4 次,每次免疫间隔7 d,免疫剂量分别为1 mL、2 mL、3 mL、4 mL。终免后第7 天,对免疫兔进行心脏采血,收集新鲜血液于采血管中。所有采集血液先于37 ℃静置2 h,再置于2 ℃~8 ℃保存,使血清充分析出。 将血液以4 000 r/min 离心15 min,收集血清作为定型原血清,按0.01%(V/V)加入硫柳汞溶液,置2 ℃~8 ℃保存备用。

1.5.3 血清凝集素的测定 通过微量凝集试验的方法,使用U 型96 孔板,取血清80 μL 与抗原80 μL反应。将各血清分别与180 种大肠杆菌菌体微量凝集试验O 抗原逐一反应,以确定该血清与非特异性抗原的交叉凝集素。孔底出现白色扣状沉积为阴性,即血清与抗原不凝集;反之,未出现白色扣状沉积为阳性,即血清与抗原凝集;若孔底白色扣状沉积与凝集颗粒同时出现,结果判为可疑。

1.5.4 血清凝集价的测定 在U 型96 孔板中加入等量的血清原液与含0.5%石碳酸生理盐水,然后依次进行对倍稀释,每行设非特异性凝集的抗原与血清反应作为阳性对照。振荡均匀后盖上板盖,放置于湿盒中,于51 ℃反应过夜。反应完成后,对光观察结果。以出现阳性反应的血清最高稀释倍数作为该血清与抗原的凝集价。

1.5.5 血清吸收抗原的制备 选用凝集价最高的非特异性抗原的生产菌株制备吸收抗原。取冻干菌种分别接种普通肉汤复苏,37 ℃静置培养20 h,划线接种普通琼脂平板,37 ℃培养20 h。从平板上挑取光滑圆整菌落分别密集划线接种普通琼脂中管斜面数支,37 ℃培养24 h。每支中管斜面培养物用0.5%石炭酸生理盐水洗下,分别混合置分装瓶中,121 ℃高压1 h 后作为吸收抗原,待其恢复室温后置2 ℃~8 ℃保存备用。

1.5.6 定型血清的吸收与制备 将待吸收血清用0.5%石炭酸生理盐水进行5 倍稀释后,按20%(V/V)加入吸收抗原,置37 ℃200 r/min 吸收3 h,然后置2 ℃~8 ℃继续吸收至少24 h,3 000 r/min 离心15 min 后吸取上清,即为吸收过的血清。

若定型原血清被选取制备好的吸收抗原第一次吸收,则该血清为一次吸收后血清,吸收抗原为一次吸收抗原;若定型原血清被两种抗原先后吸收,则制备的血清为二次吸收后血清,吸收抗原分别为一次吸收抗原和二次吸收抗原。

每次吸收后,通过微量凝集试验方法,测定待检血清与非特异性抗原的交叉凝集情况。若非特异性交叉凝集情况已完全消除,则该血清可直接制备为定型血清;若待检血清仍与部分非特异性抗原发生交叉凝集,但凝集价远远低于其与特异性抗原的凝集价,则将血清进行适当稀释至非特异性交叉凝集完全消除,再制备成定型血清;若待检血清仍与部分非特异性抗原发生交叉凝集,且凝集价和该血清与特异性抗原的凝集价接近,则需再次选取吸收抗原并进行交叉凝集素的吸收,直至无法继续吸收及稀释,制备出定型血清。

1.5.7 定型血清质量评价 将制备好的定型血清过滤除菌后按1%(V/V)加入1%硫柳汞溶液。采用微量凝集试验方法进行特异性检查及效价测定。符合要求的血特异性血清定量分装至玻璃瓶中,1 mL/瓶,置2 ℃~8 ℃保存。

2 结果

本研究首先按照大肠杆菌定型原血清制备的方法,以大肠杆菌参考菌株CVCC1369(O26)、CVCC3800(O153)、CVCC1489(O157)、CVCC3739(O159)、CVCC3807(O163)为菌种制备免疫抗原,并用免疫抗原免疫家兔,从而获得了5 种定型原血清。通过微量凝集试验的方法,将定型原血清分别与180 种微量凝集试验抗原逐一反应,明确各定型原血清与凝集抗原的凝集价,通过制备吸收抗原对血清进行吸收及稀释的方法消除非特异性凝集,制备成大肠杆菌O 抗原定型血清。具体试验结果如下:

2.1 定型原血清的制备 按照定型原血清制备工艺,每种免疫抗原免疫4 只家兔。免疫CVCC3739(O159)抗原的家兔有1 只(14 号家兔)在加强免疫后死亡,予以淘汰,不做后续研究,其余免疫抗原的家兔均存活。由此制备了O26、O153、O157、O159、O163 共5 种血清型的大肠杆菌菌体O 抗原定型原血清。

2.2 定型原血清吸收抗原的选取 试验结果表明,不同定型原血清与非特异性抗原交叉凝集情况不尽相同,即使同一血清型组的不同家兔制备出的定型原血清与非特异性抗原反应的交叉凝集素数量也相差较大。因此本试验中,同一血清型组中选取与凝集抗原反应数量最少的定型原血清,并测定其与凝集抗原发生凝集的效价。若与待检血清发生交叉凝集效价最高的非特异性抗原,同时也是同一血清型组其他血清的交叉凝集素,则选用该抗原的生产菌株制备这一组原血清的吸收抗原(表1)。

表1 定型原血清与抗原的微量凝集试验结果

由表1 可以看出,O26、O153、O157、O159、O163血清型组分别选取2 号、5 号、11 号、15 号、17 号原血清进行进一步凝集价的测定。与2 号、5 号、11号、15 号、17 号原血清发生交叉凝集的效价最高的非特异性抗原分别为O154、O155、O56、O107、O127。另外,O154、O155、O56、O107、O127 同时也分别为同一血清型组内其他血清的交叉凝集素。因此,选取O154、O155、O56、O107、O127 抗原的生产菌株分别制备O26、O153、O157、O159、O163 血清型组内的各个定型原血清的吸收抗原。

2.3 定型原血清第一次吸收后的凝集情况 吸收抗原O154 吸收O26 血清型组的1~4 号血清,吸收抗原O155 吸收O153 血清型组的5~8 号血清,吸收抗原O56 吸收O157 血清型组的9~12 号血清,吸收抗原O107 吸收O159 血清型组的13、15、16 号血清,吸收抗原O127 吸收O163 血清型组的17~20号血清。吸收后,再通过微量凝集试验的方法,测定能与一次吸收后血清发生凝集的抗原及凝集效价(表2)。

2.4 定型血清的制备 本研究采用吸收与稀释相结合的方法制备了5 种大肠杆菌菌体O 抗原定型血清,并将制备好的定型血清效价稀释至1∶2,置于2 ℃~8 ℃保存备用。具体制备方法如下。

2.4.1 O26 定型血清制备方法的确定 将O26 血清型的1~4 号血清均用O154 抗原吸收后,一次吸收后血清1~4 号与O26 抗原的凝集价为210至211,此外吸收后的1~4 号血清与部分非特异性抗原发生交叉凝集,但凝集价远低于其与特异性抗原的凝集价。则将一次吸收后血清1~4 号混合后,按512(29)倍稀释,至非特异性交叉凝集情况完全消除,制备成O26 定型血清。

2.4.2 O153 定型血清制备方法的确定 将O153血清型的5~8 号血清均用O155 抗原吸收后,一次吸收后血清5~8 号与O153 抗原的凝集价为28至210。此外,吸收后的5~8 号血清与O155 抗原的凝集价为28至210,6~8 号血清与O48 抗原的凝集价均为29至210。由于一次吸收后的5 号血清只与1 种非特异性抗原(O155)发生交叉凝集且凝集价接近其与特异性抗原的凝集价,而6~8 号血清与2 种非特异性抗原(O155、O48)发生交叉凝集且凝集价接近其与特异性抗原的凝集价,故而淘汰6~8 号血清。

由于5 号血清一次吸收后,与特异性抗原O153反应的凝集价和与非特异性抗原O155 反应的凝集价接近,且O155 已经为5 号血清第一次吸收的抗原,则不需选取吸收抗原再次进行交叉凝集素的吸收。遂将一次吸收后血清5 号,按128(27)倍稀释,至仅剩余1 种非特异性交叉凝集素(O155)未消除,制备成O153 定型血清。

表2 一次吸收后血清与抗原的微量凝集试验结果

2.4.3 O157 定型血清制备方法的确定 将O157血清型的9~12 号血清均用O56 抗原吸收后,一次吸收后血清9~12 号与O157 抗原的凝集价为28至29。此外,吸收后的9~12 号血清与O115 抗原的凝集价也为28至29。由于第一次吸收后的9~12 号血清仍与1 种非特异性抗原(O115)发生交叉凝集且凝集价接近其与特异性抗原的凝集价,则选取O115 为9~12 号血清的二次吸收抗原,进行定型血清的二次吸收。随后,通过微量凝集试验的方法,测定能与二次吸收后血清发生凝集的抗原及凝集效价(表3)。

由于第二次吸收后的9~12 号血清仍与O115非特异性抗原发生交叉凝集且凝集价接近其与特异性抗原O157 的凝集价,这与第一次吸收后的凝集情况一致,但就凝集效价来说较第一次吸收后的相比大大降低。因此,不考虑进行该血清型组的二次吸收。将用O56 吸收抗原一次吸收后的9~12号血清混合后,按256(28)倍稀释,至仅剩余1 种非特异性交叉凝集素(O115)未消除,制备成O157 定型血清。

表3 O157 血清型组二次吸收后血清与抗原的微量凝集试验结果

2.4.4 O159 定型血清制备方法的确定 将O159血清型的13、15、16 号血清均用O107 抗原吸收后,一次吸收后血清13、15、16 号与O159 抗原的凝集价为210至211。此外,吸收后的13、15、16 号血清与部分非特异性抗原发生交叉凝集,但凝集价远低于其与特异性抗原的凝集价。则将一次吸收后血清13、15、16 号混合后,按128(27)倍稀释,至非特异性交叉凝集情况完全消除,制备成O159 定型血清。

2.4.5 O163 定型血清制备方法的确定 由表2 可知,将O163 血清型的17~20 号血清均用O127 抗原吸收后,吸收后的9~12 号血清与O163 抗原反应的凝集价为20至22。试验结果表明,吸收后血清与抗原发生凝集的凝集价不但接近,而且其与特异性抗原的凝集价表现为较低水平。综合以上结果,不考虑选取吸收抗原进行该血清型组交叉凝集素的吸收,而是直接采用血清原液稀释的方法制备定型血清。通过微量凝集试验的方法,测定能与17~20 号原血清发生凝集的抗原及具体凝集效价(表4)。

由于17~20 号原血清与特异性抗原O163、非特异性抗原O41 及O127 的凝集价较高但却接近,即将17~20 号原血清按512(29)倍稀释,至剩余2种非特异性交叉凝集素(O41、O127)未消除,制备成O163 定型原血清。

2.5 定型血清质量评价 大肠杆菌菌体O 抗原定型血清性状为无色澄明液体;无菌生长;O26、O159 定型血清特异性良好,为单因子定型血清,O153、O157、O163 定型血清特异性较为良好,有1~2 种非特异性交叉凝集素,为定型血清(表5)。

表5 定型血清质量评价结果

3 讨论

大肠杆菌的抗原较为复杂,主要包括菌体抗原(O 抗原)、表面抗原(K 抗原)和鞭毛抗原(H 抗原)。除了O 抗原以外,其余抗原并不一定在同一菌株上同时表达。即使是同一抗原,由于化学组成不同及结构不同,可导致不同菌株在免疫学方面所表现出不同的抗原特异性,所以同一种抗原又可分为若干个血清型[5]。因此,在免疫血清学上将大肠杆菌划分为不同的血清型菌株,在实际工作中可用血清学方法进行大肠杆菌的血清型鉴定。大量研究表明,不同血清型的大肠杆菌的致病性存在较大差异,所以对大肠杆菌进行血清型鉴定进而明确该菌株的病原学意义显得尤为重要[6]。由于病原性大肠杆菌菌株与O 抗原关系密切,且O 抗原为大肠杆菌血清分型的基础,因而对大肠杆菌O 抗原的鉴定比另外两种抗原的鉴定显得更为重要[7]。

大肠杆菌的O 抗原位于细胞壁的最外层。其细胞壁由外壁层和肽聚糖组成,外壁层又由脂多糖、外膜和脂蛋白构成。脂多糖位于细胞壁的最外层,由脂类A、核心多糖和特异性多糖构成。其中,特异性多糖为脂多糖的最外层,即为大肠杆菌菌体O 抗原的主要成分,决定了大肠杆菌的抗原性。O抗原是由若干低聚糖重复单位构成的多糖链,由于低聚糖的组成和数量不同、低聚糖单位间的联接键不同等因素导致了O 抗原的多样性[8]。目前,已知的大肠杆菌有180 种不同结构的O 抗原,这些O 抗原具有较好的免疫原性,免疫动物即可获得高效价的相应的抗血清。但是,由于构成低聚糖的单糖的合成酶基因具有较高的同源性,导致不同大肠杆菌O 抗原血清型的抗血清之间存在交叉凝集[9]。

大肠杆菌的抗血清主要是用不同大肠杆菌的抗原分别免疫动物而获得的。通过免疫家兔制备相应的抗血清是最为常用的方法。抗血清特异性良好与否决定了试验的准确性,所以探索制备出特异性良好的大肠杆菌抗血清具有重要意义[10-11]。制备特异性较好的抗血清的过程中,吸收是消除抗血清非特异性凝集的经典而有效的方法,另外,稀释的方法也常被应用到细菌抗血清的制备中。本研究采用吸收与稀释相结合的方法以消除制备的大肠杆菌O 抗原定型抗血清的非特异性凝集,从而获得特异性较好的定型血清。

本研究以大肠杆菌参考菌株CVCC1369(O26)、CVCC3800(O153)、CVCC1489(O157)、CVCC3739(O159)、CVCC3807(O163)为菌种,利用大肠杆菌定型原血清制备的方法,微量凝集试验的方法,对抗血清吸收和稀释的方法等,最终确定了5 种大肠杆菌O 抗原定型血清制备方法,为提高大肠杆菌血清型鉴定的准确性提供了物质基础。但在试验过程中仍遇一些问题,如制备的O153、O157、O163 定型血清非单因子定型血清,均有不同数量的交叉凝集素无法彻底清除,O157 血清型组第二次吸收后血清与第一次吸收后血清的凝集效价相比普遍降低等。鉴于以上结果,本实验室日后将进一步改良制备工艺,从而制备出特异性优良的大肠杆菌O 抗原定型血清。