欧洲盘羊捻转血矛线虫感染的诊断及病理学观察

刘 青，邱 波，孟令军，仉 伟，黄永红，傅苗裔，谢绪昌

(1.济南动物园，山东济南250031；2. 山东省药学科学院，山东济南250101)

捻转血矛线虫(Haemonchuscontortus)属于毛圆科、血矛属，是寄生在羊等反刍动物皱胃和小肠内的一种寄生虫[1]，可诱发贫血、消瘦、生理机能紊乱等慢性消耗性症状，幼年动物急性感染易导致死亡。

本园人工饲养的欧洲盘羊为群养， 其中3只幼年个体相继出现精神萎靡不振、食欲降低、粪便稀薄如水等症状。捕捉后颈静脉采血进行血液常规检测，显示红细胞总数6.27×1012/L，血红蛋白55 g/L，呈贫血状。翌日清晨死亡1只，剖检可见皱胃内有大量活动的粉白色线状寄生虫，黏膜弥漫性出血，内容物呈粉红色；瓣胃及十二指肠前段亦可见少量虫体，其他器官未见明显眼观病变。取另2只幼年个体新鲜粪便进行镜检观察，可见大量已开始孵化的幼虫卵，粪便虫卵数量约1.2×104个/g。

1 材料

1.1 病料 对死亡盘羊进行剖检，取皱胃内成虫进行形态特征及镜检观察，-20 ℃保存；取皱胃组织用中性福尔马林溶液固定保存。

1.2 主要试剂 快速DNA提取检测试剂盒、2×TaqPCR Mastermix,购自天根生化科技(北京)有限公司；福尔马林、伊红、苏木素等,购自北京索莱宝科技有限公司。

1.3 PCR引物 采用严若峰等[2]设计的引物P18S、P5.8SDW和 P5.8UP、P28S分别对血矛线虫的ITS1和ITS2片段序列进行PCR扩增(P18S: 5′-GTAACAAGGTATCTGTAGGT-3′,P5.8SDW:5′-ATCGATACGCGAATCAACCG-3′；P5.8UP：5′-GCATAGCGCCGTTGGGTT-3′,P28S:5′-GGCTTCTCCCCGTTCACA-3′)，预期扩增片段的大小分别为500 bp和400 bp，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

2 方法

2.1 虫体的形态学观察 取长短不同的虫体放置载玻片上，显微镜镜检观察，根据形态区分雌雄个体。

2.2 虫体的PCR检测

2.2.1 模板DNA提取 取低温保存的雄虫、雌虫，分别放入1.5 mL离心管中，加入50 μL缓冲液B1，用研磨杵充分研磨至溶液浑浊，加入50 μL缓冲液B2，震荡混匀，12 000 r/min离心2 min，吸取上清液于另一干净的1.5 mL离心管中作为模板备用。

2.2.2 ITS序列的扩增 建立20 μL反应体系：2×TaqPCR Mastermix 10 μL，ddH2O 7 μL，上、下游引物各0.5 μL，模板2 μL。

扩增条件：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性40 s，57 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，共35个循环；最后72 ℃延伸10 min。

电泳及成像：将所得PCR产物5 μL及DL-2 000 Marker加入1.2% 琼脂糖凝胶进行电泳检测，电压100 V，30 min后成像系统拍照观察结果。

2.2.3 序列测定与分析 将PCR产物送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，并将测序结果与NCBI中的序列进行BLAST比对分析。

2.3 病理学观察 将中性福尔马林固定的组织进行修整，常规方法制作石蜡切片，经H.E.染色后对病变部位进行镜检观察。

3 结果与分析

3.1 形态学观察结果 经测量雄虫体长约2～3 cm，镜检可见交合伞分3叶，背叶小呈圆形，两侧叶发达；交合刺一对呈楔形，其近端较宽，远端窄小，末端膨大成1小结；雌虫可达3 cm以上，腹部内充满虫卵的子宫和肠管盘绕呈双色螺旋状，阴门位于虫体后部(见中插彩版图1)。

3.2 PCR检测结果 PCR产物成像结果分别在400 bp和500 bp处有一条带(见图2)，与预期结果一致，判定为捻转血矛线虫。将两段序列分别与NCBI上的序列进行BLAST比对，结果显示雌虫ITS1同源性在95%，雄虫同源性92%；雌雄个体ITS2片段同源性均较高，达98%。

图2 捻转血矛线虫ITS1、ITS2基因PCR扩增结果

1：雌虫ITS1序列；2：雄虫ITS1序列；M：DNA分子质量标准；3：雌虫ITS2序列；4：雄虫ITS2序列

3.3 病理学观察结果 镜检显示低倍镜下，皱胃黏膜上皮细胞结构正常，黏膜固有层内及黏膜间存在多灶性的虫体及虫卵。高倍镜下，虫体及虫卵周围有少量炎性细胞浸润，周围的腺体组织未见明显的变性、坏死等病理学变化(见中插彩版图3)。

4 讨论

捻转血矛线虫ITS序列在种内相对保守，目前ITS序列分析已经在寄生虫及其他病原鉴定和分类中发挥了重要作用[3-4], 是种间鉴定的理想遗传标记，可以作为捻转血矛线虫的分子鉴别标志之一。本试验中分离所得的欧洲盘羊捻转血矛线虫ITS2序列与NCBI中公布的其他序列具有较高的同源性，雌雄个体在ITS1片段的保守型表现的差异尚需进一步研究，两段序列均可与其他毛圆科属线虫相区分。

捻转血矛线虫口囊内有一圈长矛状的牙齿也被称为背齿，可咬住宿主的胃壁，在吸血时前端刺入黏膜内，可使胃肠的黏膜层受损[5]。本试验中对皱胃病变部位的镜检观察发现，虫体及虫卵周围的腺体组织并未见明显的变性、坏死等病理学变化，说明胃肠功能损伤不是引起宿主急性死亡的主要原因，及时有效改善贫血、补充体液、驱虫可以达到良好的治疗效果。根据临床治疗结果发现，常规剂量的驱虫药物使用效果不理想，这与虫体耐药性和药物质量等因素有关[6]，保证安全的前提下，可加大药物使用剂量，对病重个体前期应以营养补液消炎为主。

本次捻转血矛线虫的感染可能与采食含有虫卵的新进鲜草有关，当季雨水丰富，利于寄生虫的孵化繁殖，因此在以后的工作中应注意对鲜草的寄生虫检测，尤其是新来源的牧草更应加强重视,避免外源性感染虫卵的摄入。