云南松胚性愈伤组织诱导研究

谢忠利 李 旦 陈远书 于相君 古 旭 何承忠

( 1. 西南林业大学云南省高校林木遗传改良与繁育重点实验室，云南 昆明 650233；2. 西南林业大学云南生物多样性研究院，云南 昆明 650233)

云南松（Pinus yunnanensis）为松科（Pinaceae）松属（Pinus）常绿乔木，是以云南省为分布中心的西南山地特有树种[1]，主要分布于北纬23°～29°，东经96°～108°，为木材与树脂生产的主要树种，其产品涵盖造纸、栲胶、医药等领域，对生态建设和经济建设有举足轻重的作用[2]。然而现存的云南松优株数量极少，弯、扭木衰退现象明显，制约云南松经济效益、生态效益和社会效益的发挥。同时，云南松优株的结实率低，种子繁殖后代分化严重，扦插生根困难成活率低，嫁接技术要求高难以推广。通过离体培养技术实现快速繁殖，不仅可推进优良苗木大规模高效繁殖和商业化生产，实现松树良种品种化应用的捷径，还可为松树遗传改良过程中的分子育种搭建平台，也能为种质资源的中长期保存提供参考[3]。

自1985年，Hakman等[4]从挪威云杉（picea abies）未成熟合子胚培养中首次获得了体细胞胚及其再生植株以来，针叶类树种的胚胎发生技术得以快速发展。截至目前已有糖松（Pinus lambertiana）[5]、湿地松（P. elliottii）[6]和红松（P.koraiensis）[7]等30多种松属树种通过体胚发生途径获得了再生植株。但云南松体胚发生技术尚处于探索阶段，还没有再生植株的报道。大量研究表明，合子胚的发育阶段直接影响着体胚诱导的成败，大多数树种的未成熟种子比成熟种子更容易诱导胚性愈伤组织。为此，本实验选取未成熟云南松种子作为外植体，探究不同外植体类型、采果母树基因型、培养基等因素对云南松胚性愈伤组织诱导的影响，为云南松体胚发生技术体系建立奠定基础，也为进一步开展云南松优株规模化育苗提供一种周期短、繁殖率高、性状稳定的方法。

1 材料与方法

1.1 材料采集及处理

于2015年7月8日起从西南林业大学后山采集12株云南松的球果用于合子胚发育阶段研究，球果采集间隔4 d，每棵树共计采集5次。在筛选出最适种子采集时间后，于第2年从云龙县天池国家自然保护区采集8棵云南松优株未成熟球果，依次编号为 072、073、074、075、076、078、079、080，每棵采15～20个未成熟球果，用于胚性愈伤组织诱导培养基筛选和基因型影响研究。2个研究阶段的球果带回实验室，用75%乙醇溶液浸泡8 min，加硅胶密封后存放于4 ℃冰箱中，备用。

1.2 实验方法

1.2.1 种子表面消毒实验

将新鲜球果剖开取出未成熟种子，将其放入培养瓶中加洗涤剂流水冲洗2 h，之后采用3种方法在超净工作台中进行种子表面消毒处理，分别为处理1：75%乙醇溶液消毒3 min，无菌水冲洗2～3次，0.1%升汞浸泡10 min，无菌水冲洗4～5次；处理2：75%乙醇溶液消毒30 s，无菌水冲洗2～3次，2%次氯酸钠浸泡15 min，无菌水冲洗4～5次；处理3：75%乙醇溶液消毒30 s，无菌水冲洗2～3次，0.1%升汞浸泡10 min，无菌水冲洗4～5次。外植体经消毒处理后接种在培养上，每皿接种10个外植体，接种接2皿，3次重复。接种21 d后观测统计污染率和成活率。

1.2.2 不同采果时期的合子胚发育状态观测

取出保存于4 ℃的不同时期采集的球果，把球果剖开，剥取球果中部种子，用镊子和剪刀去除种壳，解剖针挑出合子胚，将合子胚置于体视荧光显微镜下（M165FC），观察合子胚形状并拍照，根据前人的研究[8]划分合子胚的发育时期。每株采果母树每个采果时期观测20粒种子。

1.2.3 外植体类型筛选实验

参照前人研究结果和本实验对合子胚发育状态观测结果，根据吴涛等[8]对云南松合子胚发育阶段的划分，选择合子胚处于第Ⅲ和第Ⅳ发育阶段的1株采果母树种子进行外植体类型筛选研究。在超净工作台中将表面消毒处理后的种子去除种壳，分别剥取带胚乳的合子胚[4]和合子胚作为外植体，接种于以1/2Y为基本培养基，添加2,4-D 1.1 mg/L，6-BA 0.4 mg/L，KT 0.4 mg/L，AgNO33.4 mg/L，活性炭50 mg/L，肌醇20 g/L，谷氨酰胺（Gln）0.5 g/L，水解酪蛋白（CH）0.5 g/L，蔗糖30 g/L，植物凝胶2.0 g/L的胚性愈伤组织诱导培养基中进行诱导培养。2种外植体类型，每皿接种5个外植体，接种7皿为7个重复，共接种14皿。培养21 d后观测统计胚性愈伤组织诱导率。

1.2.4 适宜培养基筛选和母树基因型的影响实验

将8株云南松优株的种子进行表面消毒处理后，参考其他针叶树体细胞胚诱导的成功试验设计[2-7,9-13]，将带胚乳的合子胚接种在以MLV、1/2LM、LM、1/2Y、S、DCR为基本培养基，添加2, 4-D（0.5、1.0、1.1、1.8、2.0、2.2、8.0 mg/L），6-BA（0.32、0.4、0.5、0.63、1.0、1.1、1.5 mg/L），KT（ 0.3、 0.4、 0.5、 0.61、 1.0 mg/L）， NAA（2.0 mg/L），AgNO3（3.4 mg/L），活性炭（50 mg/L），肌醇（0.1、0.2、1.0、20 g/L），麦芽糖（15 g/L），谷氨酰胺（Gln）0.5 g/L，水解酪蛋白（CH）0.5 g/L，蔗糖30 g/L（添加麦芽糖者除外），植物凝胶2.0 g/L，共计14种配比组合的诱导培养基。每株采果母树接种3皿，每皿接种5个外植体，3次重复，培养21 d后观测胚性愈伤组织产生情况，并计算诱导率。

1.2.5 胚性愈伤组织鉴定

取少量可能胚性愈伤组织采用醋酸洋红染色，经过制片处理后，在体视荧光显微镜（M165FC）和徕卡正置荧光显微镜（DM2500）下进行观察。诱导出的愈伤组织分为2种类型。一种为非胚性愈伤组织，形态表现为浅黄色或黄色，透明半透明，表面粗糙伴有结节颗粒，无丝状组织产生。制成玻片，在显微镜下观察到此类细胞未能被醋酸洋红染色，且细胞较大，近圆形，结构致密。另一种为胚性愈伤组织，形态表现为浅白或白色，有透明丝状组织产生，结构较为疏松，继代培养后晶莹剔透。制成玻片，在显微镜下观察到此类细胞能够被醋酸洋红溶液染为红色，且细胞核大，胞质浓厚，具有分化能力。

1.2.6 培养条件

将接种后的培养皿置于（25±3）℃的培养室内进行暗培养，湿度75%～85%。培养21 d后取出，观测统计愈伤组织诱导情况。

1.3 数据统计与分析

采用Excel 2007和SPSS 22.0软件进行数据的整理与分析。多重比较采用Duncan’s新复极差测验法进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 消毒体系对外植体污染的影响

大量文献表明，升汞具有较好的灭菌效果，但灭菌清洗后难除残毒，对处理材料有毒害作用，影响其成活或生长。采用处理1和处理3作消毒处理后，接种培养21 d的带胚乳的合子胚污染率均为0%，但其存活率也低，分别为43.67%和56.33%；采用处理2消毒处理后，带胚乳的合子胚污染率为3.3%，而其存活率达到86.89%，极显著高于处理1和处理3（表1）。综合考虑，选择处理2，即75%乙醇溶液消毒30 s，无菌水冲洗2～3次，2%次氯酸钠浸泡15 min，无菌水冲洗4～5次较适宜用于种子表面消毒，其污染率可控制在3.3%以内，满足后续实验要求。

表 1 3种消毒方法对外植体污染的影响Table 1 Effects of 3 disinfection methods on explants pollution

2.2 不同采果时期的合子胚发育状态

吴涛等[8]将云南松合子胚发育分为8个阶段。本实验5个不同采果时期的球果整体呈绿色，基部略显黄褐色，种子的种壳外观为浅黄色，质地软。在解剖镜下观察合子胚，2015年7月8日采集球果的种子合子胚95%以上处于第Ⅰ和第Ⅱ发育阶段；而7月12日的种子合子胚有85%以上处于第Ⅱ和第Ⅲ发育阶段；到7月16日，75%的种子合子胚处于第Ⅲ 和第Ⅳ发育阶段。处于第Ⅰ～Ⅳ发育阶段的合子胚，胚体半透明，轮廓尚不分明，顶端突起、圆顶形；7月20日时，大部分未成熟胚的顶端分生组织原基明显可见，子叶原基开始显露，但未超过顶端茎尖分生组织，75%处于阶段Ⅴ～Ⅵ；7月24日的合子胚已经接近成熟，子叶逐渐成形，相互间可见明显的缝隙，但合子胚发育的不同步性非常明显，能观察到云南松合子胚发育的全部8个时期，其中70%处于Ⅶ～Ⅷ 阶段（图1），处于发育Ⅰ～Ⅱ阶段约为5%。

图 1 云南松合子胚发育阶段Fig. 1 Zygote embryo of P. yunnanensis in development stages

2.3 不同外植体类型对胚性愈伤组织诱导的影响

以合子胚处于第Ⅴ～Ⅵ 阶段的球果种子为材料，分别挑取带胚乳的合子胚和合子胚作为外植体，培养21 d后观测愈伤组织和胚性愈伤组织。结果表明，2种外植体类型均可产生愈伤组织和胚性愈伤组织。以合子胚为外植体时，愈伤组织诱导率高于带胚乳的合子胚，但二者差异不显著，而以合子胚为外植体的胚性愈伤组织诱导率低于带胚乳的合子胚，且二者之间的胚性愈伤组织诱导率差异达极显著水平（P＜0.01）。以带胚乳合子胚为外植体胚性愈伤组织诱导率可达34.3%，以合子胚为外植体胚性愈伤组织诱导率为14.3%，说明带胚乳的合子胚更有利于云南松胚性愈伤组织诱导。

2.4 母树基因型对胚性愈伤组织诱导率的影响

以云龙县天池国家自然保护区8株云南松优株为对象，取其合子胚处于第Ⅴ～Ⅵ发育阶段带胚乳的合子胚为材料，接种于14种培养基中，研究云南松采果母树基因型对胚性愈伤组织诱导率的影响，结果见表2。

表 2 不同优树的胚性愈伤组织诱导效果Table 2 Effects of different elite trees on embryonic callus induction

从表2可看出：080号优树带胚乳的合子胚在14种培养基上均能诱导出胚性愈伤组织，诱导率在4.8%～23.8%之间；其次是079和076号优树，各有1种培养基未能诱导出胚性愈伤组织；而072号优树有6种培养基不能诱导产生胚性愈伤组织。从14种培养基的通用性来看，6#培养基均能对8株优树诱导产生胚性愈伤组织，诱导率在4.8%～23.8%之间；而5#、9#和11#培养基各有3株优树不能诱导获得胚性愈伤组织。8株优树在14种培养基上的胚性愈伤组织平均诱导率差异达极显著水平，变异幅度在5.1%～19.5%之间，076号优树具有最高诱导率，而075号优树的诱导率最低，二者之间差异极显著。由此可知，基因型对云南松胚性愈伤组织诱导具有极显著影响。

2.5 培养基对胚性愈伤组织诱导的影响

以8株云南松优树带胚乳的合子胚为外植体，接种于14种培养基，暗培养21 d后的愈伤组织诱导率和胚性愈伤组织诱导率见表3。14种培养基均能诱导出愈伤组织和胚性愈伤组织，且愈伤组织诱导率较高者，诱导产生胚性愈伤组织的可能性也较大，但2类愈伤组织诱导率之间不完全相关，如1#、6#、8#和12#培养基的愈伤组织诱导率较高，在50.5%～59.3%之间，最大值出现12#培养基，最小值出现在8#培养基，差异不显著，但该4种培养基的胚性愈伤组织诱导率变化范围为12.1%～17.6%，最大值出现在6#培养基，最小值出现在1#培养基，且差异达显著水平。结合愈伤组织和胚性愈伤组织诱导率，云南松未成熟胚的胚性愈伤组织诱导适宜培养基为3#、6#和12#。

表 3 不同培养基的胚性愈伤组织诱导效果Table 3 Effects of different media on embryonic callus induction

2.6 胚性愈伤组织的形态特征

接种在1/2Y+2, 4-D 1.1 mg/L+6-BA 0.4 mg/L+KT 0.4 mg/L+AgNO33.4 mg/L+活性炭 50 mg/L+肌醇20 g/L+谷氨酰胺（Gln）0.5 g/L+水解酪蛋白（CH）0.5 g/L+蔗糖30 g/L+植物凝胶2.0 g/L诱导培养基中3 d后，合子胚开始响应，具体表现为胚膨大，胚轴基部有褐色突起出现，子叶分化出“点状突起”，7 d后接种的合子胚发育形成愈伤组织（图2a），15 d后胚性愈伤组织开始出现，连同非胚性愈伤组织逐渐长大（图2b）。带胚乳的合子胚响应晚于合子胚，将其接种在3号培养基中，7 d后开始膨大，珠孔末端有“突起”（图2c），15 d后“突起”生长明显，长出晶莹剔透的白色柱状物（图2d）。诱导出的愈伤组织分为2种类型，一种为非胚性愈伤组织，表现为浅黄或黄色（图2e），透明或半透明，表面粗糙或为结节状；另一种为胚性愈伤组织，形态特征为颜色浅白或白色，半透明，结构较为疏松，表面透明丝状，经继代培养后常晶莹剔透（图2f），醋酸洋红染色后可观察到胚性胚柄团（图2h、i），通常细胞较小，近圆形，细胞核较大，胞质浓厚，具分化能力。

图 2 胚性愈伤组织的形态特征Fig. 2 Morphological characteristics of embryogenic callus

3 结论与讨论

大量研究表明，不同的外植体消毒处理方法对其污染率和愈伤组织诱导有显著影响。本实验筛选出来的最佳消毒处理为75%乙醇溶液消毒30 s，无菌水冲洗2次，2%次氯酸钠浸泡15 min，无菌水冲洗4～5次，其污染率可控制在3.3%，与齐力旺[9]的相比对外植体的毒害作用更小，成活率更高，可以节约大量时间[10]，同时污染率比白卉等[11]的低。其次，次氯酸钠能分解产生具有杀菌能力的氯气，易除去，对环境的影响也较小，又易购买，故选择次氯酸钠为处理云南松种子的灭菌剂。

赵晓敏等[12]在探究影响兴安落叶松胚性愈伤组织诱导的因子中发现，兴安落叶松带胚乳的合子胚培养有利于胚性愈伤组织的诱导。本实验采用两种类型外植体，以带胚乳的合子胚为外植体，其诱导率是合子胚外植体的两倍，这与上述结论相似。但Thompson等[2]在西部落叶松体细胞发生的研究中，采用了4种类型幼胚进行接种培养，认为直接培养带胚乳合子胚没有形成胚性培养物，而接种合子胚能诱导出胚性培养物，且诱导率为4种尖型幼胚中最高，达32%，产生这种差异的可能是物种不同造成的。

母树效应是影响体细胞胚胎发生的内在因素，是不可忽略的。Egertsdotter[13]的研究表明，针叶树种多为顽拗型植物，其体胚发生、体胚的质量及胚苗转化率更取决于母树基因型。Couée等[14]比较20个家系体胚发生能力的差异，结果表明不同家系胚性愈伤组织诱导率从4.6%～49.1%不等。本实验采用云南松8株优树带胚乳的合子胚进行胚性愈伤组织诱导，不同优树之间的诱导率差异达极显著水平，最高为19.5%，最低只有5.1%，这与前人的研究结论一致。然而，吴丽君[15]在湿地松、火炬松离体培养植株再生技术的研究中认为，树种及其基因型影响体胚发生的原因可能是不同树种、不同基因型的最适诱导培养条件不同。基本培养基、外植体、植物激素对诱导体胚发生起着重要作用[16]。Duncan等[17]、Park等[18]认为体胚发生困难的家系或基因型是可以通过培养基等培养条件的优化得以克服的。因此通过培养基的调制、激素组合或其他培养条件的优化打破母树的限制无疑是今后研究工作的重要内容。

致谢：本研究依托西南林业大学大型仪器共享平台和云南生物多样性研究院科研实验平台完成！

[ 参 考 文 献 ]

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