番茄胚性愈伤组织诱导与增殖研究

许丁帆，刘艳军，陶则满，鲜睿，范丽娜，于祎晗，徐玖，杨静慧

番茄胚性愈伤组织诱导与增殖研究

许丁帆，刘艳军通信作者，陶则满，鲜睿，范丽娜，于祎晗，徐玖，杨静慧

（天津农学院园艺园林学院，天津 300384）

为建立番茄胚性愈伤组织繁殖体系，将番茄合子胚接种于不同培养基上进行胚性愈伤组织的诱导，并将诱导出的胚性愈伤组织转接到含有不同激素的MS培养基上进行增殖培养。试验结果显示，在MS＋5.0 mg/L BA＋3.0 mg/L 2,4-D＋0.5 mg/L NAA＋60 g/L蔗糖培养基上可直接诱导出胚性愈伤组织；在MS＋2.0 mg/L BA＋0.5 mg/L 2,4-D＋30 g/L蔗糖的培养基上愈伤组织胚性化保持效果最好，生长速度最快。本试验研究结果对番茄人工种子的研制具有一定的参考价值。

番茄；胚性愈伤组织；合子胚；人工种子

番茄（）别名西红柿、洋柿子等，果实风味独特，营养价值丰富，是世界栽培最为普遍的果菜之一。番茄在我国各地普遍种植，近年来我国番茄栽培面积和产量连年递 增[1]。目前，我国番茄育种基本采用自然突变选育、人工杂交等常规方法，育种周期长、难度大、效率低。由于番茄是一种严格的自花授粉植物，接受长期的人工培育定向选择，番茄的遗传背景日益狭窄。虽然番茄育种工作已在分子水平上展开，利用分子标记技术及转基因工程技术等寻找阻止基因沉默的有效途径和发展可诱导的启动子，开发更多有重要应用价值的目的基因[2-5]，但转基因番茄的安全问题深受人们质疑。

伴随生物技术的发展，人工种子技术应运而生。植物的人工种子与天然种子类似，是通过组织培养技术，诱导植物体细胞形成在形态上和生理上均与合子胚相似的体细胞胚，然后将其包埋于有一定养分和激素等营养成分和保护功能的介质中，组成便于播种的单位，并可在适宜条件下发芽[6-8]。人工种子是一种高效快速的繁殖方法，拥有发育上的全能性和遗传上的稳定性，能够快速固定杂种优势，大大缩短育种年限，具有成本低、运输方便、适合机械化操作等优点[9-10]。

为进行番茄人工种子胚的研制，本试验采用番茄种子为外植体，诱导番茄胚性愈伤组织，从而建立稳定的番茄胚性愈伤组织培养体系，为进一步研制番茄人工种子奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

本试验所用番茄种子由天津市耕耘种业股份有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 番茄外植体处理

选取饱满的番茄种子，在超净工作台中用75%的乙醇打湿，40%的安替福民表面消毒10 min，用无菌水冲洗3次，每次冲洗10 min，冲洗后用无菌水浸泡种子2 h，备用。

1.2.2 番茄胚性愈伤组织的诱导

在无菌滤纸上用解剖刀剥除种皮，切去子叶边缘，分别接种到不同胚性愈伤组织诱导培养基上，每个培养基中接种10粒种子，每个处理重复5次。胚性愈伤组织诱导培养基采用MS为基础培养基，通过改变培养基蔗糖添加量调节培养基渗透压，配合不同种类和用量的植物激素，7 g/L的琼脂粉固化，调节pH为5.8。培养条件为：光照24 h，光照强度1 000 lx，培养温度（24±1）℃。每天观察记录番茄种子的愈伤组织诱导情况，30 d后配合显微镜观察，计算番茄愈伤组织诱导率，记录胚性化情况。

愈伤组织诱导率/%＝诱导出愈伤组织的外植体数/接种外植体数×100

1.2.3 番茄胚性愈伤组织增殖培养

将番茄胚性愈伤组织用镊子分成大小约5 mm×5 mm的小块，接种在不同的增殖培养基上，从中筛选出既保持胚性，又有良好增殖效果的培养基配方。增殖培养基采用MS为基本培养基，分别附加不同浓度的BA和2,4-D，并添加30 g/L蔗糖、7 g/L琼脂粉，调节pH＝5.8。每个培养基接种6块胚性愈伤组织，每个培养基重复5次。培养条件：连续光照，光照强度2 000 lx，培养温度为（26±1） ℃。每天观察记录番茄愈伤组织的生长变化，30 d后统计番茄胚性愈伤组织的增殖生长情况。

2 结果与分析

2.1 不同培养基对番茄胚性愈伤组织诱导的影响

外植体在胚性愈伤组织诱导培养基上培养9 d后，在种子的切口处陆续出现愈伤组织，继续培养则愈伤组织数量增加，其在不同胚性愈伤组织诱导培养基上的诱导情况明显不同。30 d后，将诱导的愈伤组织取出用显微镜观察，确定愈伤组织的胚性，试验结果见表1。

表1 不同培养基对番茄胚性愈伤组织的诱导结果

由表1可知，当蔗糖浓度为30 g/L时，采用不同浓度BA与2,4-D组合，均可诱导出愈伤组织，且愈伤组织诱导率达100%；随着BA和2,4-D浓度的增加，愈伤组织质地变硬，结构也变得紧密，但所有愈伤组织经显微镜观察发现均无胚性；BA与2,4-D浓度不变，改变培养基蔗糖添加量为60 g/L，培养基渗透压增加，愈伤组织诱导率较30 g/L蔗糖时明显降低，但随着激素用量增加，愈伤组织诱导率也增加，经显微镜观察，诱导出的愈伤组织细胞质浓度大，液泡小，细胞核较大，细胞个体较小，是典型的胚性愈伤组织类型，但此时愈伤组织生长缓慢，而且结构也较紧密；在培养基4、5、6的基础上添加0.5 mg/L NAA后，愈伤组织诱导率明显提高，且愈伤组织质地变硬、结构变松散，显微镜观察诱导的愈伤组织均具胚性，为理想的愈伤组织类型；在9号培养基上愈伤组织诱导率最高，达98%，诱导所得的愈伤组织质地硬，结构松散且具有胚性。因此，MS＋5.0 mg/L BA＋3.0 mg/L 2,4-D＋0.5 mg/L NAA＋60 g/L蔗糖为理想的番茄胚性愈伤组织诱导培养基。

2.2 不同激素组合对番茄胚性愈伤组织增殖的影响

将获得的番茄胚性愈伤组织继续在MS＋5.0 mg/L BA＋3.0 mg/L 2,4-D＋0.5 mg/L NAA＋60 g/L蔗糖的培养基上继代培养，愈伤组织结构越来越紧密，最后无法分离，并且出现组织化现象。为获得稳定生长、结构松散的胚性愈伤组织，需改变培养基组成，筛选出愈伤组织增殖效果好的培养基。番茄胚性愈伤组织在不同胚性愈伤组织增殖培养基上生长情况不同，见表2。

表2 不同激素组合对番茄胚性愈伤组织增殖培养的结果

从表2可以看出，只添加BA，愈伤组织生长速度慢，愈伤组织质地硬、结构紧密，培养一段时间后，愈伤组织变绿，出现分化现象和组织化现象，愈伤组织向着组织分化方向发展，同时愈伤组织胚性消失；当只添加2,4-D时，愈伤组织生长迅速，但愈伤组织质地较软且不具有胚性，说明2,4-D不利于愈伤组织胚性的保持，会使胚性化的愈伤组织再次进入脱分化状态；当培养基BA浓度保持不变，2,4-D浓度逐渐增大时，愈伤组织生长速度加快，愈伤组织质地变软，胚性化逐渐消失；当培养基中2,4-D浓度不变，BA浓度逐渐增加，愈伤组织生长速度未见明显变化，但愈伤组织胚性化数量逐渐增多，说明BA是愈伤组织保持胚性化的关键。在培养基5中，愈伤组织生长速度快且保持胚性，愈伤组织质地与结构为理想的松散型硬胚性愈伤组织。因此，选择MS＋2.0 mg/L BA＋0.5 mg/L 2,4-D＋30 g/L蔗糖作为番茄胚性愈伤组织增殖培养基效果最好。

3 讨论

3.1 外植体对胚性愈伤组织遗传稳定性的影响

有研究认为，含有胚性细胞的组织容易获得胚性愈伤组织，合子胚是诱导植物体胚发生最理想的材料[11-12]。其容易获得胚性愈伤组织的原因，可能是利用胚性外植体诱导胚性愈伤组织的过程实质上是胚性细胞的增殖过程。体胚再生系统由于胚性愈伤组织周围的细胞分裂快，使细胞分化和成熟，而中央细胞有丝分裂活性低，有利于保持遗传稳定性，从而使体胚再生系统的无性系变异小[13]。而王锦楠等[14]认为，外植体与胚性愈伤组织之间遗传稳定性相对较低。因此，如何保证番茄在诱导胚性愈伤组织过程中的遗传稳定性，是利用番茄胚性愈伤组织进行人工种子胚研制的关键。本试验采用番茄成熟合子胚为外植体，直接诱导产生番茄胚性愈伤组织，在一定程度上保证了体胚再生的遗传稳定性。

3.2 BA与2,4-D对胚性愈伤组织胚性化保存的影响

建立稳定的胚性愈伤组织增殖体系是获得大量人工种子胚材料的基础。胚性愈伤组织的快速增殖与胚性保持需要适宜的激素条件和充分的养分供给。而使用高浓度的植物激素会使胚性愈伤组织增殖速度降低，甚至导致体细胞胚成熟能力丧失等[15]。本试验在胚性愈伤组织增殖培养时发现，2,4-D对愈伤组织胚性化具有双重效应，较低浓度的2,4-D有利于胚性愈伤组织保持胚性状态，而高浓度抑制愈伤组织胚性化，这与高洁等[16]诱导绿花百合胚性愈伤组织研究结果一致。试验还发现，BA与2,4-D的比例对于愈伤组织的发育方向有较大的影响。当BA与2,4-D比值较高时，愈伤组织向着胚性化发展；当其比值较低时，愈伤组织向着薄壁细胞发展。

3.3 渗透压对胚性愈伤组织诱导的影响

培养基中常用的渗透压调节剂有蔗糖、聚乙二醇及山梨醇等。渗透压调节剂在植物离体培养中的作用主要是引起细胞失水，使细胞内含物升高，从而达到调整细胞状态的作用[17]。本试验采用蔗糖调节培养基渗透压，试验结果显示，较高的渗透压能够促进番茄愈伤组织胚性化，有利于胚性愈伤组织的产生。与邝哲师等[18]诱导荔枝愈伤组织的结果一致，发现蔗糖浓度过低（＜3%）或过高（＞7%），对胚性愈伤组织的诱导和生长有阻碍作用。有研究认为，植物体细胞胚性化诱导中，适度的逆境胁迫有利于细胞的胚性化[19-20]，其原因可能是逆境胁迫时，细胞生长速度减慢，分裂速度减缓，为细胞营养积累和遗传物质的合成提供了时间保证，对诱导胚性发生有利。本试验在诱导胚性愈伤组织时，采用的高渗透压对番茄种子造成一定的逆境胁迫，从而愈伤组织胚性化程度高。

4 结论

本研究以番茄成熟种子为外植体，建立稳定的番茄胚性愈伤组织增殖体系，具体试验方法总结如下：选取饱满的番茄种子，经过表面消毒，剥去种皮并造成伤口，接种到MS＋5.0 mg/L BA＋3.0 mg/L 2,4-D＋0.5 mg/L NAA＋60 g/L蔗糖的胚性愈伤组织诱导培养基上，可以获得结构松散、质地较硬的胚性愈伤组织；胚性愈伤组织在MS＋2.0 mg/L BA＋0.5 mg/L 2,4-D＋30 g/L蔗糖的培养基上可稳定增殖，并保持胚性化。这些胚性愈伤组织可为番茄胚状体发生及人工种子的制作研究奠定基础。

[1] 王莲莲. 大棚无公害番茄早春栽培技术[J]. 农民致富之友，2019（6）：28-34.

[2] 邱小芳，常婧，侯雷平，等. 番茄快繁体系的建立[J]. 山西农业科学，2015，43（10）：1259-1262.

[3] 李倩，王滨，李培环，等. 番茄子叶和下胚轴离体再生体系的建立[J]. 北方园艺，2015（1）：106-110.

[4] Amna Shoaib，Zoia Arshad Awan，Kashif Ali Khan. Intervention of antagonistic bacteria as a potential inducer of disease resistance in tomato to mitigate early blight[J]. Scientia Horticulturae，2019，34（6）：252-260.

[5] 刘思言，王丕武，关淑艳，等. 番茄种子消毒方法及愈伤组织诱导的初步研究[J]. 河南农业科学，2012，41（3）：113-115.

[6] 李晋华，赵德刚，赵懿琛. 小黄姜人工种子技术探索[J]. 分子植物育种，2018，16（24）：8148-8154.

[7] 段莹星. 植物组织培养技术的应用[J]. 农村经济与科技，2018，29（12）：33.

[8] 潘胤池，李林，肖世基，等. 白及繁育技术研究进展[J]. 中成药，2018，40（5）：1142-1149.

[9] 张虹. 仙茅组织培养和人工种子研究[D]. 长沙：中南林业科技大学，2017.

[10] 陈彦羽. 玉露人工种子制备研究[J]. 林业建设，2016（5）：47-49.

[11] 常胜合，孙威，黄东梅，等. 植物胚性愈伤诱导的机理及提高途径[J]. 基因组学与应用生物学，2018，37（12）：5455-5459.

[12] 戴小英，刘新亮，章挺，等. 樟树胚性愈伤组织诱导与体胚发生研究[J]. 江西农业大学学报，2019，41（6）：1120-1129.

[13] 杜丽. 香樟体胚发生途径的植株再生体系的建立以及农杆菌介导遗传转化的初步研究[D]. 武汉：华中农业大学，2005.

[14] 王锦楠，李际红，亓晓，等. 欧石楠体细胞胚再生过程中遗传稳定性的RAPD和ISSR分析[J]. 植物生理学报，2015，51（4）：488-494.

[15] 宋跃，甄成，张含国，等. 长白落叶松胚性愈伤组织诱导及体细胞胚胎发生[J]. 林业科学，2016，52（10）：45-54.

[16] 高洁，王元忠，黄衡宇. 绿花百合胚性愈伤组织诱导与植株再生研究[J]. 植物研究，2016，36（1）：52-57.

[17] 吴丽芳，魏晓梅，陆伟东. 白刺花胚性愈伤组织诱导和植株再生体系建立[J]. 植物生理学报，2019，55（2）：218-224.

[18] 邝哲师，周丽侬，马雪筠，等. 荔枝体胚发生及成苗研究[J]. 广东农业科学，1997（1）：16-18.

[19] 宁娜娜，邓为，朱仲龙，等. 红花玉兰胚性与非胚性愈伤组织的诱导及生理生化差异分析[J]. 分子植物育种，2018，16（10）：3278-3285.

[20] 杨玲. 花楸种子生物学和体细胞胚发生体系研究[D]. 哈尔滨：东北林业大学，2007.

Study on embryogenic callus induction and proliferation of tomato

XU Ding-fan, LIU Yan-junCorresponding Author, TAO Ze-man, XIAN Rui, FAN Li-na, YU Yi-han, XU Jiu, YANG Jing-hui

（College of Horticulture and Landscape,Tianjin Agricultural University,Tianjin 300384,China）

In order to establish the propagation system of tomato embryogenic callus, the embryogenic callus was induced by inoculating tomato seed embryo on different media, and the induced embryogenic callus was transferred to MS media containing different hormones for propagation culture. The results showed that embryogenic callus could be induced directly on MS＋ 5.0 mg/L BA＋ 3.0 mg/L 2,4-D＋ 0.5 mg/L NAA medium containing 6% sucrose, and embryogenic callus could be maintained best and grew fastest on MS＋2.0 mg/L BA＋ 0.5 mg/L 2,4-D＋30 g/L sucrose medium. The results of this experiment have certain reference value for the development of tomato artificial seeds.

tomato; embryogenic callus; zygotid embryo; artificial seed

1008-5394（2020）03-0022-04

10.19640/j.cnki.jtau.2020.03.005

S641.2

A

2020-03-22

天津市科技计划项目（18ZXBFNC00370）；邯郸市科学研究与发展计划项目（1812106033）

许丁帆（1997-），男，硕士在读，主要从事园艺植物育种研究。E-mail：1424039435@qq.com。

刘艳军（1970-），男，高级实验师，硕士，主要从事园艺植物组织培养和分子育种研究。E-mail：liuyanjun00a@126.com。

责任编辑：杨霞