响应面优化碱降解红树莓籽高聚原花青素 及对降血糖酶活性抑制作用

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(1.渤海大学食品科学与工程学院,辽宁省食品安全重点实验室, 生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心,辽宁锦州 121013; 2.大连中超食品有限公司,辽宁大连 116400; 3.辽宁新大地实业发展集团有限公司,辽宁沈阳 110168)

红树莓属蔷薇科悬钩子属多年生灌木植物,又称覆盆子、托盘和马林等,果实营养丰富,有“水果中的阿司匹林”美誉[1]。红树莓极不耐储运,多加工成果汁、果酒及果酱等产品。红树莓加工副产物红树莓籽中富含黄酮、鞣花酸和原花青素等活性物质,但对其开发利用较少,造成资源浪费[2]。红树莓籽中原花青素是由黄烷-3-醇单体缩合成的聚多酚类物质,聚合度在2～4间为低聚体,聚合度高于4为高聚体[3],具有抗氧化、降血糖及降血脂等功能,但其生物活性随聚合度升高逐渐下降[4]。随着人们生活水平提高,糖尿病患病率逐渐升高,现降糖药物多为人工合成,工艺复杂,造价昂贵[5]。研究发现低聚原花青素对α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase,α-Glu)和α-淀粉酶(α-amylase,α-Amy)活性具有抑制作用,避免蔗糖、麦芽糖及淀粉等分解为单糖,减缓餐后血糖升高[6-7],故将高聚原花青素降解具有一定必要性。

目前,高聚原花青素降解主要有酸、碱、氢化及生物酶等降解法。吴迪[8]通过酸法降解原花青素高聚体,平均聚合度由5.51降至2.6。施雅等[9]通过氢化降解将金荞麦高聚原花青素平均聚合度由6.3降为2.2。苏惠娟[10]采用N-乙酰神经氨酸裂解酶降解高聚原花青素,得到大量单体及二聚体。综合比较,酸降解产量低,氢化降解安全性要求高,生物酶解菌种选取复杂。而碱法降解相对其它方法具有产量高、成本低及操作便捷等优点[11],但其降解条件还需进一步探索。本文通过单因素和响应面试验优化碱降解红树莓籽高聚原花青素工艺条件;其次,对红树莓籽高聚原花青素及其降解后的低聚原花青素进行α-Amy和α-Glu酶活性抑制试验,探究对两种酶活性抑制作用,为其降血糖提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

红树莓籽 大连中超食品有限公司;儿茶素标准品(≥98%) 如吉生物科技公司;阿卡波糖(≥98%) 北京索莱宝科技有限公司;氢氧化钠、碳酸氢钠、碳酸钠、亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、淀粉、香草醛、无水乙醇、冰乙酸、甲醇、石油醚 天津市天力化学试剂有限公司;HPD100大孔树脂、3,5-二硝基水杨酸、α-Glu(酶活30000 U/g)、α-Amy(酶活2000 U/g)、4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷 天津市光夏精细化工研究；以上试剂 均为分析纯。

ALPHAI-2LDP plus真空冷冻干燥机 北京奥创兴业有限公司;VICTOR X3酶标仪 美国 PerkinElmer公司;MicBio-II酶标板恒温振荡器 合肥艾本森科学仪器有限公司;RE-52旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂;GT-100高通量研磨仪 北京格瑞德曼有限公司;UV-2700紫外可见分光光度计 日本岛津有限公司;BT-100恒流泵 上海青浦沪江西仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 红树莓籽原花青素提取及分级 红树莓籽研磨成粉过60目筛后,与石油醚以1∶10 (g/mL)混合,水浴50 ℃下脱脂4 h,抽滤后得红树莓籽脱脂粉。将此粉在乙醇浓度80%、料液比1∶15 (g/mL)、温度50 ℃下提取1 h,抽滤取上清液,55 ℃旋转蒸发至无醇味,真空冷冻干燥得原花青素粗提物。红树莓籽原花青素粗提物经HPD100大孔树脂吸附饱和后,40%乙醇初次洗脱得到低聚原花青素,再经70%乙醇二次洗脱得到平均聚合度为5.44的高聚原花青素[8],冷冻干燥成粉备用。

1.2.2 高聚原花青素碱降解 参照苏惠娟[10]方法略有更改,准确称取一定量1.2.1方法制备的红树莓籽高聚原花青素粉于试管中,按一定料液比分别加入一定浓度碱液,置于水浴中,在一定温度及时间下降解后,0.1 mol/L盐酸溶液调pH至7.0,终止反应。

1.2.3 碱降解单因素试验

1.2.3.1 碱液种类选择 分别以氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠、亚硫酸氢钠、亚硫酸钠为降解液,在反应温度60 ℃、反应时间40 min、碱液浓度3%、料液比1∶10 g/mL下,根据原花青素平均聚合度确定降解碱液。

1.2.3.2 料液比选择 以亚硫酸钠为降解液,在反应温度60 ℃、反应时间25 min、碱液浓度3%下,考察料液比为1∶1、1∶5、1∶10、1∶15、1∶20 (g/mL)时高聚原花青素降解效果,根据原花青素平均聚合度确定料液比。

1.2.3.3 碱液浓度选择 以亚硫酸钠为降解液,在料液比1∶10 (g/mL)、反应温度60 ℃、反应时间25 min下,考察碱液浓度为1%、2%、3%、4%、5%时高聚原花青素降解效果,根据原花青素平均聚合度确定碱液浓度。

1.2.3.4 反应温度选择 以亚硫酸钠为降解液,在料液比为1∶10 (g/mL),碱液浓度3%,反应时间25 min下,考察反应温度为30、40、50、60、70 ℃时高聚原花青素降解效果,根据原花青素平均聚合度确定反应温度。

1.2.3.5 反应时间选择 以亚硫酸钠为降解液,在料液比1∶10 (g/mL)、碱液浓度3%、反应温度60 ℃下,考察反应时间为20、30、40、50、60 min时高聚原花青素降解效果,根据原花青素平均聚合度确定反应时间。

1.2.4 响应面优化碱降解试验 在单因素试验基础上,以料液比(A)、碱液浓度(B)、反应温度(C)、反应时间(D)为因素,原花青素平均聚合度为响应值,采用Design-Expert8.0.6软件Box-Behnken进行试验设计,见表1。

表1 响应面试验因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.2.5 原花青素平均聚合度测定

1.2.5.1 原花青素质量浓度标准曲线 称取儿茶素标准品5 mg,甲醇定容至25 mL,分别移取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于试管中,甲醇分别定容至1 mL,分别加入5 mg/mL香草醛-甲醇溶液6 mL和浓盐酸3 mL,摇匀,30 ℃水浴避光1 h,以甲醇为空白,测定500 nm处吸光值[12],以儿茶素质量浓度x(μg/mL)为横坐标,吸光值y为纵坐标,绘制的标准曲线为y=0.0012x-0.0028,R2=0.9993。

1.2.5.2 原花青素物质的量标准曲线 称取儿茶素标准品2.5 mg,冰乙酸定容至25 mL,分别移取以上溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于试管中,冰乙酸分别定容至1 mL,各加入5 mg/mL香草醛-乙酸溶液6 mL和浓盐酸3 mL,30 ℃水浴避光反应1 h,以冰乙酸为空白,测定500 nm处吸光值[8,10],以儿茶素物质的量浓度x(μmol/mL)为横坐标,吸光值y为纵坐标,绘制的标准曲线为:y=2.4899x-0.0063,R2=0.9995。

1.2.5.3 原花青素平均聚合度测定 碱降解得到的不同聚合度原花青素配制成1 mg/mL样液,根据1.2.5.1和1.2.5.2方法得到原花青素质量浓度及物质的量,计算原花青素平均聚合度[12],见公式(1)。

式(1)

式中:m-原花青素质量,μg;M-儿茶素相对分子质量,290.27;n-原花青素物质的量,μmol。

1.2.6 原花青素对α-Glu和α-Amy活性抑制试验

1.2.6.1α-Glu活性抑制测定 分别准确称取一定质量高聚原花青素及其降解后的低聚原花青素粉末,配制成浓度分别为0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mg/mL的溶液,同时以阿卡波糖作为阳性参照物,分别取上述不同浓度的溶液60 μL于96孔酶标板中,各加入50 μL 0.2 U/mL的α-Glu,于酶标板恒温振荡器中振荡均匀后37 ℃下保温10 min。再加入50 μL的5.0 mmol/L 4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷振荡均匀后37 ℃下保温20 min。最后,在405 nm波长处测吸光度。以缓冲溶液作空白,其它条件不变,测吸光度。每个样品重复3次取平均值[13-14],抑制率计算见公式(2)。

式(2)

式中:AS-样品在405 nm波长处吸光度;A0-空白在405 nm波长处吸光度。

1.2.6.2α-Amy活性抑制测定 分别取40 μL 1.2.6.1中配制的各浓度高聚原花青素、降解后的低聚原花青素及阿卡波糖溶液于25 mL试管中,并以等量磷酸钠缓冲溶液做空白,加入200 μL 1.0 U/mL的α-Amy溶液,在37 ℃水浴中保温10 min,加入400 μL 1.0 g/100 mL的可溶性淀粉于25 ℃反应10 min。加入1.0 mL DNS试剂终止反应。在沸水浴中加热5 min后冷却至室温,加10 mL蒸馏水稀释,在540 nm波长处测吸光度,抑制率计算同公式(2)。

1.3 数据处理

采用Microsoft Word 2003软件对数据进行整理绘图,SPSS 22.0软件对数据进行差异显著性分析(p=0.05)。

2 结果与分析

2.1 碱降解单因素试验结果与分析

2.1.1 碱液种类对降解效果影响分析 碱液种类对红树莓籽高聚原花青素降解效果如图1所示,氢氧化钠、碳酸氢钠及亚硫酸氢钠降解高聚原花青素,其平均聚合度差异不显著(p>0.05);但与碳酸钠和亚硫酸钠平均聚合度差异显著(p<0.05)。高聚原花青素降解后平均聚合度由低到高依次为亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、氢氧化钠、碳酸氢钠和碳酸钠,亚硫酸钠降解效果最佳,是因亚硫酸钠溶液与其它碱液相比,水解后pH适中,促进高聚原花青素末端C-C键断裂,达到降解目的[11]。因此,选亚硫酸钠为降解剂。

图1 碱液种类对降解效果影响Fig.1 Effects of alkali types on degradation注：不同小写字母表示组内差异显著, p<0.05;图2～图5,图7～图8同。

2.1.2 料液比对降解效果影响分析 料液比对红树莓籽高聚原花青素降解效果影响如图2所示,料液比在1∶1～1∶10 (g/mL)内,原花青素平均聚合度显著下降(p<0.05);料液比为1∶10 (g/mL)时,降解效果最佳;随后原花青素平均聚合度显著升高(p<0.05),可能因高聚原花青素降解体系中随碱液比例增大,体系中pH发生变化,当料液比为1∶10 (g/mL)时,体系pH适于高聚原花青素的降解[10]。因此,选取料液比为1∶10 (g/mL)。

图2 料液比对降解效果影响Fig.2 Effects of ratio-liquid ratio on degradation

2.1.3 碱液浓度对降解效果影响分析 碱液浓度对红树莓籽高聚原花青素降解效果影响如图3所示,碱液浓度1%～2%时平均聚合度显著下降(p<0.05);碱液浓度为2%时,高聚原花青素降解效果达最佳;碱液浓度2%～3%时差异不显著(p>0.05);3%～5%时平均聚合度显著升高(p<0.05),说明亚硫酸钠溶液浓度过大,不利于高聚原花青素降解。因此,选用碱液浓度为2%。

图3 碱液浓度对降解效果影响Fig.3 Effects of liquor concentration on degradation

2.1.4 反应温度对降解效果影响分析 反应温度对红树莓籽高聚原花青素降解效果影响如图4所示,温度在30～50 ℃时平均聚合度略有降低,但差异不显著(p>0.05)。温度在50～60 ℃时平均聚合度显著下降(p<0.05),可能此温度下,亚硫酸钠溶解度较大,与底物反应更加充分。温度在60～70 ℃时平均聚合度显著升高(p<0.05),是因裂解的原花青素单体在过高温下发生氧化聚合反应[10]。故选取反应温度为60 ℃。

图4 反应温度对降解效果影响Fig.4 Effects of reaction temperature on degradation

2.1.5 反应时间对降解效果影响分析 反应时间对红树莓籽高聚原花青素降解效果影响如图5所示,降解20～30 min时平均聚合度降低趋势不显著(p>0.05),降解30～40 min时平均聚合度显著下降(p<0.05),随后平均聚合度逐渐升高,是因降解剂与底物反应需要一定时间,且时间过长对反应不利。故选择反应时间为40 min。

图5 反应时间对降解效果影响Fig.5 Effects of reaction time on degradation

2.2 碱降解工艺优化

2.2.1 模型建立与显著性分析 根据表1确定的响应面因素与水平,利用Design Expert-8.0.6软件,通过Box-Behnken设计得到29组碱降解试验,中心点试验重复5次,结果见表2。利用响应面软件对表2数据进行分析,得到响应面试验模型回归系数及显著性检验结果,见表3。

表2 响应面试验设计方案及结果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

表3 模型回归系数显著性检验结果Table 3 Analysis of variance for the fitted regression model

2.2.2 响应面交互作用分析 根据回归方程得到图6中各因素交互作用的等高线和响应面图,响应面图较直观地反映了各自变量对原花青素平均聚合度的影响,如响应曲面坡度越陡峭,等高线图中椭圆越扁,表明因素对平均聚合度影响较大,即影响显著,反之不显著[15]。根据等高线图和响应面图形状,可分析两两因素对红树莓籽原花青素平均聚合度交互作用的影响。图6a1和6a3中响应面图坡度陡峭,图6b1和6b3等高线图均略扁,故交互项AB和AD对高聚原花青素降解效果影响显著;图6a2中响应面图坡度陡峭,但图6b2中等高线较椭且较密集,图6a4、6a5和6a6中响应面图坡度较陡峭,图6b2、6b4、6b5和6b6等高线图均呈椭圆,且等高线密集,故交互项AC、BC、BD和CD对高聚原花青素降解效果影响均极显著,与模型系数显著性检验结果一致。由图6a1、6a2、6a3、6a4、6a5和6a6可知,当其它因素取零水平时,随料液比、碱液浓度、反应温度及反应时间单一变量的增大,原花青素平均聚合度均呈先升高后降低趋势,故在所选因素参数范围内均存在极值,可对红树莓籽高聚原花青素降解最佳工艺进行预测。由图6的响应面图和等高线图及F值可知两因素对高聚原花青素降解效果影响大小依次为:BC>AC>BD>CD>AB>AD。

图6 各因素交互作用响应面图及等高线图Fig.6 Responese surface and contour plots注：a1～a6是各因素响应面图；b1～b6是各因素等高线图。

2.2.3 验证试验结果分析 通过响应面模型确定原花青素降解最佳条件:亚硫酸钠浓度2.13%、料液比1∶10.25 g/mL、降解时间41.44 min、反应温度60.12 ℃,原花青素平均聚合度理论值为2.12。考虑实际操作条件,将降解工艺条件修正为:亚硫酸钠浓度2.13%、料液比1∶10.25 g/mL、反应时间42 min、反应温度60 ℃,此条件下进行3组验证试验,原花青素平均聚合度为(2.14±0.11)<4,即为低聚原花青素,相对误差1.43%<5%,说明经过该响应面优化得到的高聚原花青素降解工艺参数准确可靠,具有实际应用价值。

2.3 原花青素对α-Glu和α-Amy活性抑制结果分析

2.3.1 对α-Glu活性抑制结果分析 如图7所示,随阿卡波糖、低聚及高聚原花青素质量浓度增大,α-Glu抑制率均显著升高(p<0.05),质量浓度越高,酶活抑制性越好,可能是因阿卡波糖、低聚及高聚原花青素降低了α-Glu活性,使其水解硝基苯-β-D-葡萄糖醛酸苷为对硝基苯酚能力降低[16];阿卡波糖、低聚及高聚原花青素对α-Glu的IC50分别为0.338、0.291和0.730 mg/mL。低聚原花青素对α-Glu活性抑制效果远强于高聚原花青素,略高于阿卡波糖,说明高聚原花青素降解后得到的低聚原花青素对α-Glu活性抑制效果明显提高,且与阿卡波糖抑制效果相似,具有一定降糖功效。

图7 红树莓籽原花青素对α-Glu活性抑制Fig.7 Inhibitory effect of red raspberry seeds proanthocyanidins on the activity of α-Glu

2.3.2 对α-amy活性抑制作用结果分析 图8所示,随阿卡波糖、低聚及原花青素浓度增大,对α-Amy活性抑制效果显著升高(p<0.05),是因α-Amy活性被抑制,进而抑制淀粉水解为还原糖[17-18]。阿卡波糖、低聚及高聚原花青素对α-Amy的IC50分别为0.354、0.342和0.578 mg/mL。高聚原花青素对α-Amy活性抑制效果较低,低聚原花青素及阿卡波糖浓度低于0.4 mg/mL时,低聚原花青素抑制效果高于阿卡波糖,但浓度高于0.4 mg/mL后,抑制效果低于阿卡波糖,整体抑制效果与阿卡波糖效果相近,说明降解得到的低聚原花青素活性更高,可通过抑制α-Amy活性,减少淀粉被人体消化吸收,抑制餐后血糖水平的升高。

图8 红树莓籽原花青素对α-Amy活性抑制作用Fig.8 Inhibitory effect of red raspberry seeds proanthocyanidins on the activity of α-Amy

3 结论

红树莓籽脱脂后,经提取和分级纯化得到高聚原花青素,通过单因素试验确定高聚原花青素降解剂为亚硫酸钠,并在此基础上进行响应面优化,确定最佳降解条件:碱液浓度2.13%、料液比1∶10.25 g/mL、反应时间42 min、反应温度60 ℃,此条件下原花青素平均聚合度为2.14±0.11,属低聚原花青素。高聚原花青素降解前后体外降血糖活性比较表明,降解后的低聚原花青素对α-Glu和α-Amy活性抑制效果更强,阿卡波糖、低聚及高聚原花青素对α-Glu的

IC50分别为0.338、0.291和0.730 mg/mL,对α-Amy的IC50分别为0.354、0.342和0.578 mg/mL,高聚原花青素降解提高了其利用率,对α-Glu和α-Amy抑制效果大幅度增强,且低聚原花青素抑制效果与阿卡波糖相近,为新型降血糖药物开发提供理论基础。