新型耐热耐酸普鲁兰酶的 分离纯化与酶学特性分析

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(1.徐州工程学院食品(生物)工程学院,江苏徐州 221018; 2.江苏智荟生物科技有限公司,江苏徐州 221018; 3.邳州市金大地肥料有限公司,江苏徐州 221018)

普鲁兰酶是一种水解支链淀粉分支点中的α-1,6-糖苷键的酶[1],主要使支链淀粉型多糖的分支链脱离主链,从而加速糖化过程,有效的提高淀粉利用率和水解效率,降低能耗[2]。在食品领域,通常与淀粉酶结合使用,生产果糖和麦芽糖糖浆[3]。当普鲁兰酶以普鲁兰糖为原料时，水解产物主要是麦芽三糖糖浆,其在食品工业中有重要应用价值,与麦芽糖浆、葡萄糖浆等相比,其优势主要体现在:抑制食品的冰点凝固、赋予柔和的甜度、增加持水性、防止淀粉重结晶、减少色素形成等[4]。因此,普鲁兰酶可以在焙烤食品、甜点以及医药注射代替葡萄糖等领域中应用[5-6]。在生物能源方面,以淀粉等生物质资源开发乙醇、丁醇等生物燃料也是当前能源开发的热点[7]。

普鲁兰酶广泛分布于丝状真菌、细菌、酵母、植物和动物中[6],如芽孢杆菌(Bacillussp.)AN-7[8],厌氧芽孢杆菌(Anoxybacillussp.)LM18-11[9],水栖热袍菌(Thermotoganeapolitana)[10],巴伦葛兹类芽孢杆菌(Paenibacillusbarengoltzii)[11]。然而,由于酶在产量、稳定性及特殊环境下的活性等局限,用于工业化生产的普鲁兰酶非常有限。目前,很多研究报道了不同特性的普鲁兰酶,如嗜热栖热菌(ThermusthermophilusHB27)[12]来源的耐热性达到70 ℃的普鲁兰酶;来源于嗜碱芽孢杆菌(Bacilluspseudofirmus703)的耐受表面活性剂的普鲁兰酶[13]。虽然有不同特性的普鲁兰酶报道,但是特性单一,不能满足对多种特性需求的工业化生产需要,如目前淀粉糖化过程一般在60 ℃高温和pH4.5的弱酸性条件下进行48～60 h[9],在此过程中普鲁兰酶不仅要维持高的催化活性还要保持高稳定性,而根据文献，符合这种多元化条件的普鲁兰酶非常有限。

本研究首次从泡盛曲霉中分离纯化的普鲁兰酶，不仅具有较高的酸、热稳定性,并能在酸性、高温环境下维持高活性,同时对普鲁兰糖具有专一的高效催化活性。该酶有望在麦芽三糖糖浆生产、食品饮料、生物能源、日用洗涤剂等行业领域应用。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

菌种 本实验室从土壤样品中分离的一株菌株XF;普鲁兰糖 Sigma公司;三羟甲基氨基甲烷(Tris)、甘氨酸、牛血清白蛋白、及低分子量蛋白Marker 上海生工生物工程有限公司;Sephacry S-100、DEAE-Sepharose Fast Flow、Phenyl-Sepharose 6 Fast Flow Pharmacia公司;种子培养基(w/v) 2%糯米淀粉,2% 酵母提取物,0.5% NH4H2PO4,0.2% NaNO3,0.1% NH4NO3、0.2% KH2PO4,0.1% NaCl,0.05% MgSO4·7H2O,0.01% ZnSO4·7H2O,0.01% FeSO4·7H2O,调整pH调至5.5;发酵产酶培养基 在种子培养基的基础上加入2%的蛋白胨,其他不变。

AKTA Explorer 100型蛋白质纯化系统 美国GE公司产品;Hoefer 2-D Electrophoresis电泳系统 美国HOEFER公司;SIGMA3K30型台式冷冻离心机 德国Sigma公司;UV-2450紫外可见光分光光度计 日本岛津公司。

1.2 实验方法

1.2.1 产普鲁兰酶菌株的鉴定 对实验室分离保藏的产普鲁兰酶菌株XF形态鉴定,28 ℃培养约3～6 d,观察并记录菌落形态、菌丝特征、产孢结构。并进一步进行分子生物学鉴定。提取菌株XF基因组,参照文献[14]PCR扩增真菌鉴定通用ITS基因序列,选用通用引物为ITS1:5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′;ITS4:5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。PCR扩增产物由北京三博远志生物技术有限公司测序完成,测得序列在NCBI中的BLAST程序寻找与其有最大同源性的序列,最终鉴定菌株XF。

1.2.2 粗酶液的制备 在4 ℃固体PDA培养基保存的菌株,充分活化后,接到种子培养基中,培养好后再按照体积比10%的接种量转接到发酵产酶培养基。发酵条件:250 mL三角瓶装60 mL发酵液,180 r/min,38 ℃发酵6 d。然后用6层纱布将菌体过滤,滤液10000 r/min离心10 min,上清即为粗酶液。

1.2.3 PulXF活力及蛋白质浓度测定

1.2.3.1 PulXF活力的测定 酶活测定参照文献[15],略有改动。以普鲁兰糖为底物测定PulXF活力。对每步纯化的酶液用磷酸缓冲溶液(pH5.0,50 mmol/L)稀释后取0.5 mL,加入至2 mL含0.5%(g/mL)普鲁兰糖的磷酸缓冲溶液(pH5.0,50 mmol/L)中,在60 ℃下反应20 min,加入1 mL的DNS溶液沸水浴煮10 min,补充去离子水使反应体系稀释至15 mL。迅速冷却后在540 nm波长下测定溶液的吸光值。分光光度计测定酶解体系吸光值所用的空白对照同以上体系,但在加DNS后,沸水浴前加入0.5 mL酶液。

酶的活力单位定义为:在最适条件下,每分钟水解普鲁兰糖释放1 μmol还原糖(以葡萄糖计)所需的酶量,为1个活力单位。其中,还原糖量测定采用二硝基水杨酸(DNS)法[16]。

1.2.3.2 蛋白质浓度测定 酶液每步的纯化步骤中酶液蛋白质浓度的测定采用Bradford法[17],以牛血清白蛋白作为标准蛋白,蛋白质浓度标准曲线方程为y=3.27x+0.653,相关系数R2=0.9954,y为吸光度,x蛋白质浓度,mg/mL。

1.2.4 PulXF的分离纯化

1.2.4.1 硫酸铵分级盐析 向发酵获得的粗酶液中缓慢加入硫酸铵,并在磁力搅拌器上连续搅拌,使其逐级达到20%饱和度,待充分沉淀后,4 ℃条件下8000 r/min离心10 min,取上清,继续加入硫酸铵至饱和度80%,充分沉淀后再次4 ℃、8000 r/min离心10 min,收集沉淀,pH6.0、20 mmol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液溶解,充分透析脱盐。

1.2.4.2 离子交换柱层析 经硫酸铵沉淀,透析除盐后的PulXF粗酶液采用离子交换层析进一步纯化,并选用改变洗脱液离子强度的方法对PulXF进行梯度洗脱。DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换介质的层析柱(1.6 cm×30 cm)用pH6.0、20 mmol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液充分平衡,上样透析脱盐后的粗酶液,同样缓冲液洗脱至洗脱曲线走平,用含NaCl的缓冲液进行0～1 mol/L的线性梯度洗脱。流速0.8 mL/min,每管收集3 mL,紫外监测波长280 nm。测定每管PulXF活性及蛋白质浓度。

1.2.4.3 分子筛凝胶过滤层析 将离子交换层析后所得含有活性的收集管合并,超滤管浓缩后,上样至Sephacryl S-100分子筛柱(1.6 cm×70 cm)分离纯化,20 mmol/L的柠檬酸-磷酸缓冲液洗脱,流速0.8 mL/min,每管收集2 mL。

1.2.4.4 疏水层析 将处理好的Phenyl-Sepharose 6 Fast Flow树脂装柱,用含有0.4 mol/l的(NH4)2SO4的pH6.0,20 mmol/L Na2HPO4-柠檬酸缓冲液充分平衡至OD280基线走平。分子筛纯化后的样品超滤浓缩后上样,用pH6.0,20 mmol/L Na2HPO4-柠檬酸的缓冲液洗脱至流出液的OD280降到0.1以下。再用含(NH4)2SO4的Na2HPO4-柠檬酸缓冲液(pH6.0、20 mmol/L)进行1～0 mol/L浓度的线性梯度洗脱,流速为0.8 mL/min,每2 mL收集洗脱液,测酶活检测纯化情况。

1.2.5 酶纯度分析及活性电泳 酶纯度分析及分子量测定:参照Laemmli的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法进行[18]。采用4%浓缩胶、10%分离胶,以低分子质量标准蛋白(兔磷酸化酶 B:97400 Da、牛血清白蛋白:66200 Da、兔肌动蛋白:43000 Da、牛碳酸酐酶:31000 Da、胰蛋白酶抑制剂:20100 Da、鸡蛋清溶菌酶:14400 Da)作对照。

PulXF酶谱测定:与SDS-PAGE相比,酶谱测定中SDS以及β-巯基乙醇不添加,样品不煮沸。分离胶中添加0.1%的普鲁兰糖。电压80 V下电泳至样品进入分离胶时,升高电压至120 V,电泳至溴酚蓝蓝色条带移动至分离胶的最低端,结束电泳。胶置于20 mmol/L,pH5.0的柠檬酸-磷酸缓冲溶液中,50 ℃孵育1～2 h,将胶取出,加入卢戈氏碘液浸泡3～5 min,观察有无白色条带。

1.2.6 酶学性质研究

1.2.6.1 最适反应温度及热稳定性 在pH5.0及温度30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85及90 ℃下,测定温度对酶活力的影响,确定最适反应温度,以最大酶活力计为100%。以普鲁兰糖为底物,测定PulXF酶活。将酶液分别放置在不同温度30～90 ℃下保温1 h,测定残余酶活,计算相对酶活。

1.2.6.2 最适反应pH及其pH稳定性 在60 ℃反应温度下,用pH3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5及8.0的缓冲液,以普鲁兰糖为底物,测定PulXF酶活。在不同pH的缓冲液中加入一定量的酶液,28 ℃保温24 h后,标准方法测定残余酶活,以未处理的酶液的酶活计为100%,计算相对酶活。

1.2.6.3 金属离子以及常见抑制剂对PulXF的影响 在纯酶溶液中分别添加浓度均为5 mmol/L的金属盐(FeCl3、FeCl2、CaCl2、CuCl2、ZnCl2、MgCl2、KCl、NaCl、MnCl2、CoCl2、AgNO3、HgCl2、PbCl2)和不同浓度的抑制剂(0.2% DTT、1%β-巯基乙醇、1 mol/L尿素、5% SDS、5% CTAB、5% Triton X-100、5% Tween 80、2 mmol/L PMSF、5 mmol/L EDTA、30% 乙醇)分别测定酶活力,以未添加金属离子和抑制剂的酶液的酶活计为100%,计算相对酶活。

1.2.6.4 PulXF底物特异性及水解产物薄层层析 选取普鲁兰糖、可溶性淀粉、直链淀粉和支链淀粉、动物糖原、α-环状糊精、β-环状糊精作为测定酶活的底物进行分析。底物浓度为0.5%,与酶液在50 mmol/L、pH5.0的磷酸缓冲体系中60 ℃条件下反应20 min,酶作用释放的还原糖量通过DNS方法测定。

薄层层析方法参照文献[10],稍作改动。以50 mmol/L的磷酸二氢钠-氢氧化钠缓冲溶液(pH5.0)分别配制0.5%的直链淀粉、普鲁兰糖、可溶性淀粉、α-环糊精和支链淀粉溶液,各个反应体系中按照1 U/mL的量加入PulXF,均在60 ℃下反应8 h,反应后将反应产物上样到硅胶板上,以正丁醇、乙醇和水(体积比为5∶3∶2)混合溶液为展开剂,以含10%的浓硫酸的乙醇溶液为显色剂,最后在120 ℃烘箱烘干显色10 min。

1.2.6.5 PulXF动力学参数的测定 取8支试管分别加入2 mL以pH5.0、50 mmol/L磷酸缓冲溶液溶解的普鲁兰糖,使其终浓度分别为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 mg/mL,预热到50 ℃时,各加入0.5 mL适当稀释的酶液。空白对照以去离子水代替酶液,其他相同。反应10 min后,沸水浴终止反应。测定不同底物浓度时的反应速度。用Lineweaver-Burk作图法(1/V-1/[S])作图,得到动力学曲线绘制双倒数曲线,求出酶的Km值。

1.3 数据处理

实验数据用Microsoft Excel进行统计分析,方差分析组间差异,结果用“平均值±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 菌株XF的鉴定

菌株FX在PDA培养基上生长快速。菌落平坦厚度较薄,培养前期菌落褐绿色后期变为褐黑色,无渗出物,菌落边缘菌丝呈白色。高倍镜下观察产孢结构呈球状。菌落及孢子头具有典型的曲霉特征[19]。对测序序列进行BLAST比对,菌株XF ITS序列与Aspergillusawamori(KF154413,GenBANK)和Aspergillusawamori(LC032125.1,GenBANK)的基因序列同源性为99%以上,结合菌株的形体学特征,确定菌株XF为泡盛曲霉(Aspergillusawamori)。

2.2 PulXF的分离纯化

2.2.1 离子交换柱层析 离子交换层析洗脱曲线如图1所示,分离纯化过程出现7个蛋白洗脱峰。经过酶活检测后,发现第1个、第2个、第6个和第7个蛋白质洗脱峰没有PulXF活性。第3个到第5个均有酶活,第4个蛋白峰含酶量较高,且酶活较高,对应的NaCl洗脱浓度约为0.68 mol/L。

图1 PulXF的离子交换层析Fig.1 Ion exchage chromatography of PulXF

2.2.2 分子筛凝胶柱层析 分子筛层析结果如图2所示,从图2中可以看出,样品溶液分离后得到了4个独立的洗脱峰。经酶活检测后,对比蛋白质浓度曲线发现,酶活集中在3号峰,1号、2号、4号峰为杂蛋白峰。

图2 PulXF的分子筛凝胶过滤层析Fig.2 Gel filtration chromatography of PulXF

2.2.3 疏水层析 疏水层析洗脱曲线如图3所示,酶液经过疏水层析后,得到两个蛋白峰,其中第1个蛋白峰没有酶活,为杂蛋白;第2个蛋白峰具有PulXF酶活力,对应的管数为23～28,其中26号管酶活力最强,对应的硫酸铵浓度为0.45 mol/L。将收集到的洗脱峰的层析液冷冻干燥浓缩后进行蛋白电泳,考察其分离效果。经过疏水层析后,酶比活力达到309.28 U/mL,纯化倍数8.16,回收率20.05%。各步纯化情况见表1。

表1 泡盛曲霉(Aspergillus awamori)XF PulXF纯化结果Table 1 Summary of PulXF purification from Aspergillus awamori XF

图3 PulXF的疏水层析Fig.3 Hydrophobic chromatography of PulXF

2.2.4 蛋白电泳检验纯度 将收集到的不同分离阶段的PulXF液进行SDS-PAGE凝胶电泳分析,分析结果如图4A所示。图中可以看出,经离子交换层析后,虽然杂蛋白的条带大大减少,但仍有许多杂蛋白条带;而经离子交换层析后及分子筛层析后,大量的杂蛋白被去除;用以上层析以及疏水层析后,所分离纯化的PulXF组分达到了电泳纯,纯化结果为一条单一的电泳条带。所纯化出来的PulXF的分子量约为63.7 kDa。同时,活性电泳染色见图4B显示了在SDS-PAGE上相应位置的PulXF活性带清晰的条带表明,该酶在该位置完全水解淀粉,因此不被卢戈氏碘液溶液着色。

图4 蛋白质SDS-PAGE及PulXF活性电泳Fig.4 SDS-PAGE and zymogram analysis of PulXF注:1:硫酸铵盐析泳道,2:离子交换层析泳道, 3:分子筛凝胶过滤层析泳道,4:疏水层析。

2.3 PulXF最适反应温度及热稳定性

温度是影响酶活性的重要因素。从图5中可知,不同的温度对PulXF活性具有明显的影响,从黑曲霉中生产出的PulXF最佳温度是在60 ℃,在温度50～65 ℃范围内酶活力保留在90%以上,在温度45～80 ℃范围内酶活力保留在70%以上,可以看出在相当宽的温度范围内PulXF都具有良好的活性;PulXF在温度高于65 ℃时,酶活迅速下降,充分表明,提高温度可以加快反应速度,但温度升高会导致PulXF变性,从而降低活性。从图5中还可以看出,在温度90 ℃时PulXF活力没有完全丧失,酶活在40%以上,所以PulXF具有一定的耐高温特性。

图5也显示了温度在30～90 ℃内PulXF的热稳定性,结果表明,PulXF在温度30～70 ℃范围内,相对酶活都在90%以上，几乎没有什么损失，表明其在30～70 ℃内稳定性较好。温度低于80 ℃，相对酶活力均在85%以上，表明PulXF在低于80 ℃时具有良好的热稳定性。随着温度的继续上升，PulXF的相对酶活降低，表明温度高于80 ℃时，其稳定性降低。但是PulXF的热稳定性并没有完全失去，在温度为90 ℃时，相对酶活在60%左右，可见PulXF在高温下酶活还是比较稳定的。目前,在报道的普鲁兰酶中,本研究的PulXF属于热稳定性非常高的酶。耐热性酶的热稳定性是工业用途的一个重要特征,表明本实验得到的PulXF能够更好在工业生产中利用。

图5 温度对PulXF活性及稳定性的影响Fig.5 Effect of temperature on the activity and stability of PulXF

2.4 PulXF最适反应pH及pH稳定性

不同pH下的酶活性变化情况如图6所示。由6图可知,PulXF酶活随着pH的增大呈先升再降的趋势,且能在广泛酸碱pH的范围都具有活性。pH5.0时PulXF活力最大,在pH4.0～8.0之间酶活力保持在80%以上。PulXF在强酸下酶活较低,但是没有完全失去活性,pH3.0时相对酶活还保留80%。所以在强酸或强碱环境下PulXF都能在工业中发挥作用。

不同pH下处理相同时间后残余的PulXF活力如图6所示。由图6可知PulXF在pH3.5～6.5的酶活均在90%以上,酶活稳定,但当pH降至3.5以下时,稳定性急剧下降,在高酸性条件下,酶活性较低，稳定性差。总体来说PulXF在pH3.0～8.0的酶活都在75%以上,酶活稳定性相对良好,具有良好的工业应用前景。

图6 pH对PulXF活性及稳定性的影响Fig.6 Effect of pH on the activity and stability of PulXF

2.5 金属离子和抑制剂对PulXF活性的影响

大多数普鲁兰酶都需要金属离子进行激活活性和维持稳定性[20]。各金属离子及抑制剂对酶的作用结果分别见图7和图8。Ca2+、Zn2+和Mg2+对酶有激活作用,其中Ca2+对PulXF酶活激活作用最为显著,相对酶活高达136.78%。Na+、Fe3+、Co2+、Fe2+和K+对酶稳定性无明显影响,而Cu2+、Mn2+、Ag+、Hg2+和Pb2+则表现出不同程度的抑制作用,其中Hg2+和Pb2+对PulXF酶活几乎完全抑制。PulXF在二硫苏糖醇(DTT)、β-巯基乙醇、尿素、PMSF和EDTA的存在下酶活力会被抑制,而在CTAB、SDS、Triton X-100、Tween 80以及乙醇的存在下酶活比较稳定,说明酶对表面活性剂的耐受性强。

图7 金属离子对PulXF活性的影响Fig.7 Effect of mental ions on the activity of PulXF

图8 抑制剂对PulXF活性的影响Fig.8 Effect of inhibitors on the activity of PulXF

2.6 PulXF底物特异性及水解产物分析

由于酶对不同底物的结合能力不同,表现出不同的酶活,PulXF对不同底物的水解活性见图9。研究发现,PulXF对普鲁兰糖的催化能力最高,对可溶淀性粉和支链淀粉的催化能力分别为普鲁兰糖的38%、26%。PulXF对结构中只含有α-1,4-糖苷键的直链淀粉有微弱的水解作用,相对酶活仅有10.3%。对动物糖原、α-环状糊精、β-环状糊精基本检测不到酶活力。

图9 PulXF底物特异性分析Fig.9 Substrate specificity of the purified PulXF

PulXF对不同底物的水解产物情况性如图10所示,TLC分析表明,普鲁兰糖经纯化的PulXF 8 h水解后,可以彻底被完全水解,水解产物几乎全部是麦芽三糖,表明,纯化的PulXF对α-1,6-糖苷键有高效水解作用;酶对底物可溶性淀粉与支链淀粉也都有一定的水解作用,但水解作用同普鲁兰糖相比,非常弱,仅有非常少量的水解纯化的PulXF对α-1,6糖苷键有专一性的高产物葡萄糖、麦芽二糖及麦芽三糖,主要因为以上底物中也存在少量α-1,6糖苷键链接的支链结构。对直链淀粉和α-环状糊精,没有水解作用。TLC的层析结果基本同图9中PulXF对各底物的水解相对活性相一致。从酶对底物的降解特异性看出,PulXF几乎只对α-1,6糖苷键有水解作用,对照报道的普鲁兰酶的分类特性[12],PulXF为I型普鲁兰酶。

图10 PulXF对不同底物水解产物薄层层析分析Fig.10 TLC analysis of hydrolysis products from PulXF with various substrates注:M:G1葡萄糖 G2 麦芽糖,G3 麦芽三糖,G4麦芽四糖; 1:直连淀粉;2:α-环状糊精;3:普鲁兰糖 同PulXF孵育8 h后产物;4:可溶性淀粉同PulXF孵育 8 h后产物;5:支链淀粉同PulXF孵育8 h后产物。

2.7 PulXF反应动力学性质分析

图11 酶催化不同浓度的普鲁兰糖的Lineweaver-Burk曲线Fig.11 Lineweaver-Burk plot of enzyme activity of the purified a-amylase over varied concentration of pullulan

3 讨论

随着普鲁兰酶在实际生产生活中的应用越来越广,各种有关普鲁兰酶的研究报道增多。报道出不同来源的普鲁兰酶以及其酶学性质,虽然来源很多,但可用于工业化生产的非常有限[21]。目前淀粉加工工业上常需要具有热稳定性的普鲁兰酶,它能够高效的水解普鲁兰糖[22]。本研究的普鲁兰酶最适温度在60 ℃,且在80 ℃下1 h普鲁兰酶活力还保持85%以上,很适合作为工业生产用酶。嗜热型I型普鲁兰酶是淀粉水解工艺在淀粉加工工业中的理想用酶,虽然已经报道大量分离的热稳定性普鲁兰酶,但是由于酶产量低,以及pH耐受性差,所以它们的应用受到限制[10]。本研究的PulXF最佳的作用pH4.5,在pH4.0～5.5之间都保持高的水解活性,pH3.5～5.5之间有非常强的稳定性。而文献报道的大多数微生物来源的普鲁兰酶最适作用pH在5.0～9.0之间[12,23-24],pH稳定在在5.5～8.0范围内[8,25-26],而淀粉的糖化通常是在微酸性(pH4.0～5.5)条件下进行,鉴于这个原因,PulXF有潜力开发为商用普鲁兰酶,用于淀粉的糖化中。

金属离子Ca2+对酶活性有强烈的激活作用,这与文献报道的Bacilluscereus等来源的普鲁兰酶相一致[20]。另外,Mg2+和Zn2+也显著促进酶的活性。在酶的反应体系中加入EDTA明显抑制酶的活性,由此可以推断,Ca2+、Mg2+和Zn2+等二价金属离子在酶的催化活性中心对维持结构具有重要作用。表面活性剂(SDS、CTAB、Triton X-100、Tween 80)几乎对酶没有抑制作用,同报道的其他来源普鲁兰酶相比,PulXF对表面活性剂有强的耐受性,有希望添加到日用洗涤剂中,提高洗涤效果。有机溶剂通常会对酶有强烈的抑制作用,而本研究的乙醇对酶活性的影响实验显示,酶活仅有不到10%的损失,因此在生物能源方面,PulXF可以同其他糖化水解酶共同作用,用于生物质转化为工业乙醇中。

4 结论

本研究首次报道了来源于泡盛曲霉的普鲁兰酶。经过一系列的分离纯化,得到了电泳纯的普鲁兰酶。PulXF在高温下催化活性和稳定性显示较高优势。在偏酸性的环境下酶活力保持80%以上。在有机溶剂、表面活性剂等苛刻环境中,仍具有很好的耐受性。底物的特异性实验显示PulXF对含有α-1,6-糖苷键的糖类有专一性的催化作用,Km为较低,表明对普鲁兰糖有强的亲和性,属于典型的I型普鲁兰酶。总体而言,本研究从泡盛曲霉分离纯化的I型普鲁兰酶在耐热性、酸碱稳定型、有机溶剂、表面活性剂稳定性等方面,表现出强的稳定性和高活性,很有希望应用于淀粉加工、洗涤剂、微生物发酵、生物能源等领域。