金银花中总黄酮 和绿原酸加压同步提取的工艺优化

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(永州职业技术学院,湖南永州 425100)

金银花含有有机酸类、黄酮类、三萜及三萜皂苷类、环烯醚萜类、挥发油类、醇类、糖类、微量元素等化学成分[1],其中,绿原酸和黄酮类化合物是金银花的主要活性成分[2]。绿原酸有显著的抗菌消炎、清热解毒的作用,并且对肿瘤有一定的抑制效果;黄酮类化合物具有降血糖、降血脂、增进伤口愈合和止痛、增加机体免疫力等功能,同时二者还有抗衰老、抗氧化之功效[3],常应用于医药[4]、食品[5]、保健品及日化用品等,作为其优质安全的基料或功能性添加剂[6-7]。

从金银花中提取总黄酮和绿原酸的方法主要有溶剂提取法(水提法[8]、乙醇回流法[9]等)、超临界提取法[10]、辅助提取法(酶解法[11]、微波法[12]、超声法[13]及超高压法[14])等。超临界提取法、超声波提取法、微波提取法、酶解法、超高压提取法对金银花活性成分的提取效率较高[15-16],曹渊等[17]将超声波法与传统的水提法和乙醇回流法进行了对比,认为超声波法明显优于水提法和乙醇回流法。加压提取技术是近年来新推出的中草药提取工艺,具有节约提取溶剂、缩短提取时间,且能提高活性成分得率等优点[18]。宋文斌等[19]通过加压提取人参中的人参皂甙,与其他常规方法(如浸渍法、超声波法、匀质法、机械振荡法)相比,人参皂甙的提取率要高出25.88%～58.68%。目前在中草药提取方面,涉及到的研究对象还有婆罗子、三七、赤芍、牛膝、红豆杉、红三叶草、艾叶等[20-22]。

上述方法大多侧重于某一类成分的提取,存在原料利用率低、生产周期长、能耗高等问题。为此,本研究应用加压提取技术,同步提取出金银花中总黄酮和绿原酸并加以分离,对加压提取的一些影响因素进行考察,确定加压同步提取金银花中总黄酮和绿原酸的优化工艺,为金银花功能性成分的高效开发与利用,提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

金银花(50 ℃下干燥，粉碎，60目筛下物) 永州老百姓大药房提供，经永州职院孙兴力副教授鉴定为忍冬科植物忍冬的干燥花蕾；芦丁对照品 中国药品生物制品检定所；绿原酸对照品 中国食品药品检定研究院；甲醇、乙醇、亚硝酸钠、氢氧化钠、硝酸铝和磷酸等 均为分析纯。

GSH高温高压反应釜 威海朝阳化工机械有限公司；FWl77型中草药粉碎机 天津市泰斯特仪器有限公司；RE-201D-2L旋转蒸发仪 上海达丰玻璃仪器厂；TGL-18C高速台式离心机 上海安亭科学仪器厂；UV-2400紫外可见分光光度计 上海舜宇恒平科学仪器有限公司；EC2000高效液相色谱仪(色谱柱：Betasil-18C，5 μm，4.6 mm×200 mm) 大连依利特分析仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 提取工艺 精密称取金银花粉末,置于高温高压反应装置内,一定条件下加压提取;提取液过滤,滤液在室温下,以6000 r/min离心15 min得上层清液。黄酮类苷易溶于乙酸乙酯,而绿原酸极微溶于乙酸乙酯,热水中溶解度大。因此,加入与清液等体积的乙酸乙酯萃取分离黄酮和绿原酸,50 ℃时,振荡萃取5次,每次萃取时间为5 min,合并萃取液,分别得到含有绿原酸的萃余物和含有总黄酮的萃取物,两者分别通过大孔吸附树脂纯化[23-24]，冷冻干燥后备用。工艺流程如图1所示。

图1 金银花总黄酮和绿原酸的提取工艺流程图Fig.1 Process flow diagram on total flavonoids and chlorogenic extraction from Lonicerae japonicae

1.2.2 单因素实验 参照预试验,考虑规模化生产的实际,溶剂选择对绿原酸和黄酮均有较好溶解能力、且易于回收的甲醇水溶液。通过动力学和热力学两方面分析,加压提取的影响因素主要有溶剂(配比)、料液比、提取压力、提取温度以及提取时间。

1.2.2.1 甲醇浓度对总黄酮和绿原酸得率的影响 称取一定质量的金银花样品,置于高温高压反应装置内,按料液比1∶20 (g/mL)加入浓度为40%、50%、60%、70%、80%的甲醇水溶液,浸润30 min后,提取温度为70 ℃,提取压力为2 MPa,加压提取30 min后取出,依照1.2.1所述处理后,计算总黄酮和绿原酸的得率。

1.2.2.2 料液比对总黄酮和绿原酸得率的影响 称取一定质量的金银花样品,置于高温高压反应装置内,分别按料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 (g/mL)加入60%甲醇浸润30 min,提取温度为70 ℃,提取压力为2 MPa,加压提取30 min后取出,依照1.2.1所述处理后,计算总黄酮和绿原酸的得率。

1.2.2.3 提取压力对总黄酮和绿原酸得率的影响 称取一定质量的金银花样品,置于高温高压反应装置内,按料液比为1∶20 (g/mL)加入60%甲醇浸润30 min,提取温度为70 ℃,分别在0.1、1、2、3、4 MPa压力下提取30 min,依照1.2.1所述处理后,计算总黄酮和绿原酸的得率。

1.2.2.4 提取温度对总黄酮和绿原酸得率的影响 称取一定质量的金银花样品,置于高温高压反应装置内,按料液比为1∶20 (g/mL)加入60%甲醇浸润30 min,提取温度分别为50、60、70、80、90 ℃,体系内压力为2 MPa,提取30 min后取出,依照1.2.1所述处理后,计算总黄酮和绿原酸的得率。

1.2.2.5 提取时间对总黄酮和绿原酸得率的影响 称取一定质量的金银花样品,置于高温高压反应装置内,依料液比为1∶20 (g/mL)加入60%甲醇浸润30 min后,提取温度为70 ℃,提取压力为2 MPa的条件下,分别提取10、20、30、40、50 min,依照1.2.1所述处理后,计算总黄酮和绿原酸的得率。

1.2.3 正交试验 基于单因素分析,各因素分别选择三个水平进行正交试验,试验设计如表1所示。

表1 正交试验因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.2.4 对比试验 参照2015版药典[2],采用超声波辅助提取金银花中总黄酮和绿原酸,与本工艺进行对比。称取一定质量的金银花样品置具塞锥形瓶中,按料液比1∶100 (g/mL)加入50%甲醇,功率250 W,频率35 kHz,超声处理30 min,过滤,得绿原酸粗提液。称取一定质量的金银花样品置具塞锥形瓶中,按料液比1∶25 (g/mL)加入70%乙醇,功率250 W,频率35 kHz,超声处理1 h,过滤得总黄酮粗提液。二者的粗提液经本工艺相同的纯化方法提纯后,计算得率。

加压同步提取后的金银花残渣,可能是内部结构已趋于密实,继续采用加压辅助提取,效果欠佳,而采用超声辅助提取,一定程度上可改善滤渣的内部结构,实现其残余成分的提取。因此,采用上述相同的超声提取参数,考察加压辅助同步提取工艺,总黄酮和绿原酸二类成分的损失率。损失率的计算方法:损失率(%)=(提取成分的质量/原金银花粉末质量)×100。

1.3 检测方法及得率计算方式

1.3.1 黄酮的测定 黄酮类化合物含有邻苯二羟基基团,在NaNO2-Al(NO3)3系统中能于510 nm波长处产生特征性吸收,且其吸光强度与该化合物含量成一定比例关系,因此,本实验采用NaNO2-Al(NO3)3比色法对金银花总黄酮进行定量[25]。精密称取芦丁对照品20.0 mg,75%乙醇(v/v)溶解、定容至100 mL。准确吸取0.2 mg/mL 的芦丁对照品溶液0.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 mL分别置于50 mL的容量瓶中,先后加入5% NaNO22 mL、10% Al(NO3)32 mL、4.5% NaOH 20 mL,最后以75%的乙醇定容至50 mL,摇匀。以75%的乙醇为对照,于510 nm波长下测定标准系列溶液的吸光值,以浓度为横坐标,吸光度值为纵坐标,绘制标准曲线。以浓度对吸光度进行拟合,得线性回归方程为y=0.0114x+0.0066,R2=0.9996,黄酮浓度在0～48 μg/mL与吸光度呈良好的线性关系。

精密称量纯化后的总黄酮干燥样品适量,加75%乙醇溶解定容至100 mL,制成约25 μg/mL总黄酮供试溶液。采用标准对照法进行检测,计算出供试总黄酮的浓度,继而求出纯化后总黄酮的含量。

1.3.2 绿原酸的测定 绿原酸的含量参照2015版药典[2]进行检测。精密称取绿原酸对照品适量,置于棕色瓶中,加50%甲醇溶解定容至25 mL,制成40 μg/mL的绿原酸对照品溶液。分别精密移取绿原酸对照液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL于25 mL容量瓶中,50%甲醇溶液定容。流动相为乙腈-0.4%磷酸溶液(13∶87),流速1.0 mL/min,柱温25 ℃,检测波长为327 nm,进样量为10 μL,理论板数以绿原酸峰计算大于1000。在此色谱条件下,依次进样,分别记录峰面积。以吸收峰面积y为纵坐标,绿原酸浓度x(μg/mL)为横坐标绘制标准曲线。以浓度对峰面积进行拟合,得线性回归方程为y=43.0396x-56.7253,R2=0.9992,绿原酸浓度在1.6～9.6 μg/mL与峰面积呈良好的线性关系。

精密称量纯化后的绿原酸干燥样品适量,加50%甲醇溶解定容至25 mL,制成约5 μg/mL的绿原酸供试品溶液。采用外标法进行检测,计算出供试品绿原酸的浓度,继而求出纯化后绿原酸的含量。

1.3.3 得率的计算 各提取成分的得率计算方法:得率(%)=(提取成分的质量/金银花粉末质量)×100。

提取成分依据1.3.1和1.3.2的方法分析后,根据纯化后提取成分的含量计算出其质量。

1.4 数据处理

所有实验均平行进行三次,单因素实验数据以置信度95%时平均值的置信区间表示。实验数据以Excel 2013进行统计分析,并通过Origin 8.0作图;正交试验以正交设计助手II V3.1进行实验设计和数据的统计分析。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 甲醇浓度对总黄酮和绿原酸得率的影响 由图2可知,总黄酮的得率在60%甲醇中最高;绿原酸的得率随甲醇浓度的增加呈上升趋势,甲醇浓度超过60%以后,绿原酸的得率略有降低。表明金银花中总黄酮和绿原酸在60%的甲醇水溶液中已基本溶出;对于总黄酮,可能是60%的甲醇水溶液与其极性最接近,总黄酮更易溶解出来。综合来看,甲醇浓度为60%时较合适。

图2 甲醇浓度对总黄酮和绿原酸得率的影响Fig.2 Effect of methanol concentration on extraction rate of total flavonoids and chlorogenic from Lonicerae japonicae

2.1.2 提取料液比对总黄酮和绿原酸得率的影响 由图3可知,料液比对总黄酮和绿原酸的得率影响较大。随着料液比的增大,总黄酮和绿原酸的得率呈先升后降的趋势,料液比小于1∶20 (g/mL)时,增加提取液的体积,总黄酮和绿原酸的得率显著增加(p<0.05)。当提取料液比超过1∶20 (g/mL)时,提取溶剂增多,传质效果下降,导致得率略有下降;同时,溶剂用量增加,会给溶剂回收带来麻烦,造成浪费。综合考虑,选择较佳的料液比为1∶20 (g/mL)。

图3 料液比对总黄酮和绿原酸得率的影响Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of total flavonoids and chlorogenic from Lonicerae japonicae

2.1.3 提取压力对总黄酮和绿原酸得率的影响 由图4可知,当压力在2 MPa以下时,随着压力的升高,总黄酮和绿原酸的得率呈快速上升趋势;总黄酮得率在高于2 MPa后,得率的变化幅度缓慢,略有下降。一定程度上,加压可改变溶剂的溶解能力和选择性;同时,提取体系的压力加大,可能会破坏金银花内部的某些细胞壁,有利于溶剂的渗透,液体溶剂可以快速充入金银花的毛细孔内,提高总黄酮和绿原酸的浸出速度,从而得率明显升高。但当提取压力增大到一定值时,过高的压力可能使金银花紧密压缩在一起,影响溶剂的渗透浸润作用,导致得率略有下降[21]。综合考虑,本试验选取提取压力为2 MPa。

图4 压力对总黄酮和绿原酸得率的影响Fig.4 Effect of pressure on extraction rate of total flavonoids and chlorogenic from Lonicerae japonicae

2.1.4 提取温度对总黄酮和绿原酸得率的影响 由图5可知,当提取温度在60 ℃以下时,随着温度的升高,总黄酮和绿原酸的得率呈较快的上升趋势。因温度升高,溶剂的黏度和表面张力下降,相应地溶剂的渗透性和浸润能力得到提升;另一方面,升温使分子的动能增加,促进分子运动与物质交换。当提取温度超过60 ℃后,总黄酮和绿原酸的得率变化不大。其中,绿原酸的得率稍呈下降趋势,可能是高温造成绿原酸出现部分分解状况,使得率下降;而总黄酮的得率略有提高,综合考虑提取温度对总黄酮和绿原酸的得率的影响,提取温度选取70 ℃。

图5 温度对总黄酮和绿原酸得率的影响Fig.5 Effect of temperature on extraction rate of total flavonoids and chlorogenic from Lonicerae japonicae

2.1.5 提取时间对总黄酮和绿原酸得率的影响 由图6可知,在10～30 min提取时间内,随着提取时问的延长,总黄酮和绿原酸的得率逐渐提高;30 min以后,总黄酮和绿原酸的得率呈下降趋势。提取开始阶段随时间的延长,溶剂浸入物料的量逐渐增多,总黄酮和绿原酸的得率也相应增大。随着提取时间延长,一方面长时间处于高温高压状态,会使金银花有效成分出现分解,同时其他杂质也会被溶出,影响总黄酮和绿原酸的得率。因此,本试验选取加压溶剂提取时间为30 min。

图6 时间对总黄酮和绿原酸得率的影响Fig.6 Effect of time on extraction rate of total flavonoids and chlorogenic from Lonicerae japonicae

2.2 正交试验结果

基于单因素实验结果,根据表1设计选择L18(35)正交表,按照设定条件进行实验和数据的统计分析,详见表2。

由表2可知，对金银花总黄酮得率的影响,由大到小依次为:提取压力、料液比、提取时间、甲醇浓度和提取温度,提取总黄酮以A2B2C2D2E2组合最好;影响金银花绿原酸得率的主次顺序为:提取压力、料液比、提取时间、提取温度和甲醇浓度,提取绿原酸以A3B2(B3)C2D2E2组合最佳。

表2 正交试验结果Table 2 Results of orthogonal experiment

综合比较二种最佳组合,提取压力、提取时间和提取温度相同,即提取压力为2 MPa,提取时间为30 min,提取温度为70 ℃。对于甲醇浓度和料液比,A2和A3、B2和B3,相对应的二种水平影响差异较小,考虑到成本方面的因素,选择A2和B2,即甲醇溶液的浓度为60%,料液比为1∶20。综上分析,金银花总黄酮和绿原酸的最佳提取条件为甲醇浓度60%,料液比1∶20,提取压力2 MPa,提取温度70 ℃,提取时间30 min。

从表3、表4可以看出,同步提取金银花中总黄酮和绿原酸,压力对提取总黄酮的影响显著(p<0.05),而对绿原酸的提取有极显著(p<0.01)的影响。

表3 总黄酮得率的方差分析Table 3 Variance Analysis of extraction rate of total flavonoids

表4 绿原酸得率的方差分析Table 4 Variance Analysis of extraction rate of chlorogenic acid

2.3 验证实验结果

基于正交试验分析得到的最佳工艺条件,考察加压同步提取工艺的稳定性。以最优工艺对金银花样品平行提取3次,总黄酮的得率为15.66%±0.18%,绿原酸的得率为3.89%±0.07%。因此,通过加压同步提取金银花总黄酮和绿原酸的工艺具有较好的稳定性,两种成分的得率相对平均偏差均小于2%。

该工艺所有滤渣收集后,参照1.2.4中的方法,提取绿原酸按料液比1∶100加入50%甲醇,功率250 W,频率35 kHz,超声处理30 min;提取总黄酮按料液比1∶25加入70%乙醇,功率250 W,频率35 kHz,超声处理1 h,二者分别提取三次。经分析检测,绿原酸含量为0.22%,占绿原酸总量的5.35%;总黄酮含量为0.74%,占总黄酮的4.51%。因此,采用加压辅助同步提取金银花总黄酮和绿原酸,二种成分的损失率分别为5.35%和4.51%。

根据文献[2],采用相同的金银花样品和检测方法,通过超声波法分别提取绿原酸和黄酮,得率分别为2.92%和13.17%,均比该法总黄酮和绿原酸的得率要低。因此,采用加压辅助同步提取金银花总黄酮和绿原酸的工艺可行,二种成分的得率均比较理想。

3 结论

加压辅助同步提取金银花中总黄酮和绿原酸的工艺切实可行。与其它提取方法对比,提取溶剂用量少,同步提取效率高,有效降低单个活性成分的提取成本,且有利于减少提取物的热降解损失。研究结果表明,体系的压力对金银花中绿原酸和总黄酮的提取有显著的影响(p<0.05);加压辅助同步提取金银花中总黄酮和绿原酸的最佳工艺条件为:溶剂为甲醇水溶液,浓度为60%、料液比1∶20 (g/mL)、提取压力2 MPa、提取时间30 min、提取温度70 ℃，此时金银花中总黄酮和绿原酸的得率分别为15.66%和3.89%,与正交试验的结果相吻合,说明该工艺稳定、可行。本研究为金银花产业化应用提供了理论依据,同时,也为广泛开发和利用金银花资源提供了很好的参考价值。