蒲公英脂溶性成分 对沙门氏菌抑菌作用机理

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(陕西理工大学,陕西省资源生物重点实验室,生物科学与工程学院,陕西汉中 723000)

沙门氏菌(Salmonella)是一种全球性极为严重的人畜共患致病菌,是引起食物污染的主要病原菌[1]。在我国细菌性食物中毒有将近80%是由于沙门氏菌感染引起的,多数是来源于肉制品。自1885年到现在人们已经确定了伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、副伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌等多与人类食源性疾病有关系,可以引起人和动物败血症和肠胃炎,并能引起人类食物中毒,如水样腹泻、腹部绞痛、发热痛、恶心和呕吐,甚至死亡[2]。由于抗生素的不规范使用、滥用使得沙门氏菌对于大多抗生素,如β-内酰胺类抗生素、氨基糖苷类抗菌药物、氟喹诺酮类、磺胺类等药物产生了多重耐药性[3]。这种现象出现的主要原因是沙门氏菌获得了耐药基因[4-6]。Figueroa等[7]研究发现沙门氏菌对6类常用抗生素的耐药率已经超过了70%。因此,中药防治沙门氏菌不失为一个可行的方法。中药具有副作用小、效果好等特点,能有效治愈由沙门氏菌引起的各种疾病,这样不仅可以很大程度上减少抗生素的大量使用,而且也避免沙门氏菌产生耐药性[8]。

蒲公英最早记载于《唐本草》，已有数千年的研究历史[9]。蒲公英为菊科多年生草本植物,又别名黄花地丁、婆婆丁和奶汁草等,是一种药食两用的多年生草本植物,临床应用广泛,为常用的清热解毒中药[10-11]。现代药理学研究表明蒲公英具有抗菌、消炎、抗氧化、抗肿瘤、降血糖、祛色斑和对心脏有保护作用等功能[12-17]。蒲公英中含有多种功能性成分,蒲公英多糖具有一定的抗氧化作用,蒲公英黄酮对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、粪肠球菌、黑曲霉等多种致病菌都有很好抑菌功效[18-21]。蒲公英脂溶性成分大多为烷类、烷酸类、烯酸类、醇类等物质,其中9,12,15-十八烷三烯酸、9,12-十八烷二烯酸、十六酸、3,7,11,15-四甲基-2-十六烷烯-1-醇、菜油甾醇、十八酸为主要组成成分,这些成分不仅具有一定的抗氧化活性,且对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希氏菌及白色念珠菌都有良好的抑菌效果[22-23]。但是,蒲公英脂溶性成分对沙门氏菌抑菌及其机理研究鲜有报道,近期对蒲公英脂溶性成分研究主要集中在抗氧化活性和菌种抑菌等初步分析研究,很少深入到对其菌种抑菌机理方面。

本实验主要通过简单易行的索氏提取法提取蒲公英脂溶性成分[22],并利用该成分对沙门氏菌抑菌活性及抑菌机理进行了初步研究,从而为中药蒲公英治疗由沙门氏菌引起的疾病提供了基础理论依据,也为蒲公英资源的药物开发和利用做出有价值的参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

蒲公英(干品) 于陕西省汉中市中药材市场购买,经陕西理工大学李新生教授鉴定为蒲公英;鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium,ATCC14028) 由陕西理工大学陕西省资源生物重点实验室菌种保藏中心提供,-80 ℃低温冰箱冻存备用;碘化丙啶(PI) Sigma公司;琼脂粉、蛋白胨、酵母浸粉 北京奥博星生物技术有限责任公司;氯化钠 天津市盛奥化学试剂有限公司;石油醚 天津市光复科技发展有限公司;无水乙醇 天津市富宇精细化工有限公司;二甲基亚砜(DMSO) 分析纯,天津市博迪化工有限公司。

HC-250型摇摆式粉碎机 永康市天祺盛世工贸有限公司;DHG-9203A型真空干燥箱 上海精宏实验设备有限公司;2XZ型旋片式真空泵 临海市谭氏真空设备有限公司;HH-S4型电热恒温水浴锅;THZ-82型数显气浴恒温振荡器 常州市国立实验设备研究所;FA2204B型电子天平 上海精密科学仪器有限公司;TGL-20型台式高速离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司;UV2550型分光光度计 日本岛津公司;DHP-9162型电热恒温培养箱 上海一恒科学仪器有限公司;SW-CJ-1D型单人超净工作台 上海苏净实业有限公司;LDZX-50KBS型立式压力蒸汽灭菌锅 上海申安医疗器械厂;MF53型倒置荧光显微镜 日本Nikon公司;VEGA3-XMU型扫描电子显微镜 广州高测仪器有限公司;LGJ-18C型真空冷冻干燥机 北京四环科学仪器厂有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 蒲公英脂溶性成分的提取 蒲公英于70 ℃下干燥至恒重,粉碎机粉碎后过60目筛;取一定量的蒲公英粉末用滤纸包住置于索氏提取仪中,以石油醚为提取溶剂，在60 ℃恒温水浴锅下回流提取10 h,得到黄绿色的蒲公英脂溶性成分[23]。初步浓缩干燥石油醚溶剂得到浸膏,与水1∶1混合于分液漏斗中静置分层并弃去水层及水溶性色素,重复5次。然后于真空干燥箱中40 ℃挥发多余石油醚干燥得蒲公英脂溶性成分。

1.2.2 脂溶性成分的抑菌活性(纸片抑菌法) 将沙门氏菌菌种从-20 ℃冰箱中取出复苏达到室温,转涂于LB固体培养平板上,于培养箱37 ℃过夜活化培养。再挑单菌落于LB液体培养基中，37 ℃、170 r/min培养5～6 h。当OD600为0.6时,将其涂布于LB固体培养基上。吸取15 μL用二甲基亚砜(DMSO)溶解的蒲公英脂溶性成分滴加到直径6 mm的无菌滤纸片上,用镊子将其贴于涂布有沙门氏菌的LB平板上。对照纸片为含15 μL DMSO的溶剂。然后于37 ℃倒置培养18～24 h,观察实验结果,测定抑菌圈直径大小[24-25]。

1.2.3 最小抑菌浓度的测定 按照1.2.2方法活化沙门氏菌,将活化好的沙门氏菌单菌落接种于LB液体培养基,37 ℃、200 r/min培养12 h。用LB液体培养基将沙门氏菌浓度调到107cfu/mL,备用。先于10 mL试管中加入2 mL LB液体培养基,再加入蒲公英脂溶性成分使最终浓度分别为0、1、2、4、6、8、10 mg/mL。按5%(V/V)接入已调好浓度的沙门氏菌菌液,然后于37 ℃、160 r/min条件下培养24 h,600 nm下测定吸光度。在OD600紫外测定菌体浓度时,与空白对照组作比较吸收值下降50%时的样品浓度确定为最小抑菌浓度(MIC)[26]。

1.2.4 沙门氏菌细胞膜渗透性的测定 沙门氏菌细胞膜渗透性采用菌悬液中核酸含量进行表征,采用OD260法[27]。按照1.2.3方法培养沙门氏菌,将培养好的菌液于6000 r/min离心10 min,收集菌体,PBS(pH5.8)洗三次。用含0.01% Tween80的PBS悬浮菌体,调整为109cfu/mL。配制浓度为60 mg/mL蒲公英脂溶性提取物母液备用。分别向装有2.5 mL菌悬液的10 mL试管中加入蒲公英脂溶性提取物,使溶液中蒲公英脂溶性成分最终浓度分别为0、0.5、1、2×MIC;然后于37 ℃、200 r/min下培养,0、1、2、4、6 h后分别取样200 μL,于8000 r/min条件下离心10 min,260 nm下测上清液OD值。

1.2.5 沙门氏菌的电镜扫描分析(SEM) 按照1.2.3方法培养沙门氏菌,将培养的沙门氏菌菌液浓度调整为107cfu/mL,取2 mL菌悬液,分别加入蒲公英脂溶性成分,使其最终浓度为0、1、2×MIC,于气浴恒温振荡器37 ℃、200 r/min下培养。5 h后,取1.5 mL菌液,8000 r/min离心6 min,PBS(pH5.8)洗涤2次,然后加入2.5%戊二醛(以25%戊二醛、去离子水和PBS以1∶4∶5的比例配置浓度为2.5%的戊二醛溶液)固定4 h,用乙醇梯度脱水(用50%、60%、70%、80%、90%乙醇重悬浸泡10 min,8000 r/min离心6 min),无水乙醇重悬浸泡10 min,8000 r/min离心2次,每次6 min,在真空冷冻干燥机上冷冻24 h成干粉后喷金粉于SEM上观察[28]。

1.2.6 沙门氏菌的PI荧光染色分析 按照1.2.3方法培养沙门氏菌,用液体培养基将菌液OD600调至0.4。取0.5 mL菌液于放有直径15 mm无菌盖玻片的24孔细胞培养皿中,在每孔加入1.5 mL LB液体培养基,于37 ℃培养24 h,更换培养基后再分别加入蒲公英脂溶性成分,使溶液中蒲公英脂溶性成分最终浓度分别为0、0.25、0.5、1×MIC,以0×MIC作为对照。培养5 h后,取出细胞培养皿,用PBS洗2次,去除表面浮游细菌。然后在黑暗条件下用PI染色5 min,PBS洗玻片2次,荧光显微镜下观察[29]。

1.3 数据分析

利用SPSS 22.0、Origin 8.0等软件进行数据的分析、图表的制作等,实验结果取平均值。

2 结果与分析

2.1 蒲公英脂溶性成分提取物的抑菌能力

如图1,1、2处DMSO纸片周围无抑菌圈,表明二甲亚砜对沙门氏菌无抑菌效果。3、4处蒲公英脂溶性成分纸片周围有明显抑菌圈,此时蒲公英脂溶性成分浓度为10 mg/mL,对沙门氏菌的抑菌圈直径为11.3 mm。结果表明蒲公英脂溶性成分对沙门氏菌也具有一定的抑菌活性。蒲公英脂溶性成分对金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、枯草芽孢杆菌以及白色念珠菌也具有良好的抑菌效果,证明蒲公英脂溶性成分具有良好的抑菌活性,可以进一步作为对其他菌种抑菌的研究对象[22]。

图1 蒲公英脂溶性成分对沙门氏菌的抑菌作用Fig.1 Bacteriostatic effect of dandelion liposoluble to Salmonella注:1,2均表示未加入蒲公英脂溶性成分, 只添加DMSO的对照组;3,4均表示 添加了蒲公英脂溶性成分的实验组。

2.2 最小抑菌浓度的测定

如表1,随着蒲公英脂溶性提取物质量浓度的增加,其对沙门氏菌的生长抑制能力也逐渐增大,当蒲公英脂溶性提取物的浓度分别为8、10 mg/mL时,沙门氏菌的OD600值下降≥50%,可见,蒲公英脂溶性提取物对沙门氏菌的MIC为8 mg/mL。

表1 沙门氏菌的最小抑菌浓度Table 1 Minimum inhibitory concentration of Salmonella

2.3 蒲公英脂溶性成分对沙门氏菌细胞膜渗透性影响

沙门氏菌细胞膜可以起到一定的抗抑菌作用,即能够防止外源物质进入,也可阻止菌体内部物质流出。细菌的细胞膜一旦受到损坏,胞内的物质,如大分子(DNA或RNA)就会释放出来,而大分子物质在260 nm处有吸收峰,因此可以通过测定260 nm处菌悬液的吸光值来判断细胞膜的完整性[30]。由图2可知,对照组沙门氏菌在整个过程中的OD260紫外吸光度值差别比较小,没有明显变化,基本保持平稳状态,表明对照组无细胞内容物溢出。实验组随着时间的推移,OD260值呈现上升趋势,而且随着加入蒲公英脂溶性成分浓度的逐渐增大其菌悬液OD260值也增大,这说明细胞内的大分子物质流出,菌体细胞膜的通透性和完整性发生改变。另外,Moosavy等[31]提出严重的细胞形态损伤和膜破坏会增加菌体对细胞内溶物的通透性。本实验说明了蒲公英脂溶性成分是破坏了沙门氏菌细胞膜增加其通透性,导致胞内核酸物质流出,OD260值出现明显增加趋势。

图2 蒲公英脂溶性成分对沙门氏菌膜通透性的影响Fig.2 Effect of dandelion liposoluble to Salmonella membrane permeability

2.4 蒲公英脂溶性成分对沙门氏菌细胞结构的影响

不同浓度蒲公英脂溶性成分作用5 h后(图3)，对照组(图3A)沙门氏菌表面光滑,细胞膜细胞呈现短杆状,细胞膜无褶皱现象。加入浓度为1×MIC(图3B)蒲公英脂溶性成分的沙门氏菌表面极度不光滑,多数细胞呈短杆状,细胞表面褶皱加剧,有些细胞表面有撕裂和凹陷现象(图3B-a/b)。当加入浓度为2×MIC(图3C)的蒲公英脂溶性成分后,大量沙门氏菌细胞破裂,并有膜残片出现,细胞破损严重(图3C-a/b/c)。

图3 不同浓度蒲公英脂溶性成分 对沙门氏菌的影响(10000×)Fig.3 Effects of liposoluble constituents from different concentrations of dandelion on Salmonella(10000×)

2.5 PI荧光染色结果分析

注:A为0×MIC对照组;B、C实验组脂溶性成分浓度依次分别是1×MIC、2×MIC。a表示菌体细胞膜粗糙、不平整;b表示菌体细胞变形、形态不规则;c表示菌体细胞破损、膜褶皱凹凸不平、有膜残片。

由图4A可见,对照组在荧光显微镜下呈现黑色无红色激发荧光,表明未加任何蒲公英脂溶性成分时,沙门氏菌没有出现凋亡。当加入0.25×MIC脂溶性成分时,出现少量红色激发荧光,PI进入细胞内,细胞的完整性破坏,沙门氏菌出现死亡现象(图4B)。当蒲公英脂溶性成分浓度为0.5×MIC时,激发红色荧光密度比0.25×MIC有所增加(如图4C),细胞凋亡加剧;当蒲公英脂溶性成分浓度为1.0×MIC时(图4D),红色荧光数量明显增加,表明凋亡数量迅速增加,蒲公英脂溶性成分对沙门氏菌的抑制能力增强。结果表明,随着蒲公英脂溶性成分浓度的增加,沙门氏菌细胞膜受到破坏的数量增加,使得红色荧光密度随之增加。蒲公英脂溶性成分对沙门氏菌的菌体细胞膜具有一定的破坏作用,PI荧光染色结果与2.3和2.4实验结果是一致的。

图4 不同浓度蒲公英脂溶性成分对沙门氏菌的影响(40×)Fig.4 Effects of liposoluble constituents from different concentrations of dandelion on Salmonella(40×)注:图A为0×MIC对照组;图B、C、D实验组脂溶性成分浓度依次为0.25×MIC、0.5×MIC、1×MIC。图B、C、D是蒲公英脂溶性成分作用5 h分别用PI处理在倒置荧光显微镜下的曝光照片形态。

3 结论

蒲公英脂溶性成分对沙门氏菌具有一定的抑菌能力,当浓度为10 mg/mL时对沙门氏菌的抑菌直径为11.3 mm,其最小抑菌浓度为8 mg/mL。蒲公英脂溶性成分对沙门氏菌的抑菌作用主要是通过破坏了细菌膜的通透性,导致细胞内溶物流出。在不同浓度蒲公英脂溶性成分的作用下沙门氏菌细胞形态发生变化,菌体细胞膜有明显的褶皱且有破损,浓度增大后,破损现象加剧。PI染色进一步证明蒲公英脂溶性成分是通过改变沙门氏细胞膜的通透性而导致细菌死亡的。蒲公英脂溶性成分对沙门氏菌的抑菌效果显著,但其作为一种防治沙门氏菌药物开发的相关安全性评价还需更多的研究和补充分析,以确定蒲公英脂溶性成分对人和动物安全性,为蒲公英资源利用和药物开发方面提供可靠理论依据。