去甲斑蝥素抑制黑色素瘤M14细胞增殖和诱导细胞凋亡的研究

高杨，程毅，任明媛，岳育杨

黑色素瘤（黑素瘤）是一种好发于皮肤的高度恶性肿瘤，易转移、死亡率高、预后差，缺乏有效的治疗药物［1-2］。近年来肿瘤的免疫治疗研究进展较快，美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）陆续批准了抗细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4（cytotoxic T lymphocyte associated antigen-4，CTLA-4）单克隆抗体ipilimumab、抗程序性死亡受体1蛋白（programmed cell death protein 1，PD-1）单克隆抗体nivolumab和pembrolizumab用于黑素瘤的治疗［3］，但这些药物可能导致自身免疫性疾病和胃肠毒性而使部分患者终止治疗，因此继续寻找有效的治疗药物仍是临床急需解决的问题。斑蝥素是从斑蝥的干燥虫体中提取的一种抗肿瘤活性成分，具有抗肿瘤、升白细胞、增强免疫、抗病毒、抑菌及抗氧化等作用［4］，去甲斑蝥素（noncantharidin，NCTD）是斑蝥素的衍生物，由人工合成，其毒副作用比斑蝥素低，具有独特的升白细胞及较强的抗癌作用［5］。本研究通过NCTD作用于人黑色素瘤M14细胞，观察NCTD对M14细胞增殖、凋亡及凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2的影响，并探讨其可能的抗黑素瘤作用机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料 人M14黑素瘤细胞株购于中国科学院上海细胞研究所；NCTD购于美国Sigma公司，DMEM培养基购于美国Gibco公司，CCK-8试剂购于日本同仁化学研究所，兔抗人β-actin一抗、兔抗人Bax一抗、兔抗人Bcl-2一抗及辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗购于武汉ABclonal公司。倒置显微镜购于德国Leica公司，CO2培养箱购于美国Thermo公司。

1.2 方法 M14细胞培养于含10%胎牛血清的1640培养基，于37℃，5%CO2的恒温培养箱中常规培养。倒置显微镜下观察细胞形态和生长状态，待细胞融合达到90%以上时，按1∶2或1∶3的比例进行传代。

1.3 药物处理 NCTD溶于DMSO中，配成100 g/L储存液冻存于-20℃冰箱中备用，临用时用细胞培养液配制成工作浓度。

1.4 CCK-8法检测细胞活性 将对数生长期的M14细胞接种于96孔板中，每孔5×103个细胞，每组设5个平行孔，待细胞贴壁后，弃去原培养液，实验组每孔加入100 μL的NCTD，浓度分别为50、100及500 μg/L，阴性对照组加入不含药物的培养基，空白对照组只加培养基（无细胞）。分别作用24 h、48 h后，每孔加10 μL CCK-8试剂作用2 h，用酶标仪测定每孔450 nm波长的吸光度（A）值并计算生长抑制率。生长抑制率=［（Ac-As）/（Ac-Ab）］×100%。（Ac：阴性对照孔；As：实验孔；Ab：空白对照孔）

1.5 倒置显微镜观察细胞形态及DAPI核染色 将M14细胞常规培养于6孔板中，待细胞贴壁后，分别加入以不同浓度的NCTD作用24 h后，4%多聚甲醛固定15 min，用PBS室温清洗3遍，每次10 min，0.1%triton-X 100处理5 min，PBS室温清洗3遍，每孔加入浓度为1 mg/L的DAPI染液，常温避光孵育10 min，后用PBS清洗3遍后，于倒置显微镜观察细胞形态变化，荧光显微镜观察细胞核的变化。

1.6 蛋白免疫印迹（Western blot）法检测凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的表达 药物持续干预细胞24 h后，收集并裂解细胞，BCA蛋白定量试剂盒检测总蛋白量。样本经10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（100 V恒压）分离，以凝胶面积0.65 mA/cm2恒流电转移45 min，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，分别加入1∶1 000的兔抗人Bax一抗、兔抗人Bcl-2一抗，4℃孵育过夜，漂洗后加入1∶3 000的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗，37℃避光孵育1 h，TBST洗涤，ECL化学发光显色试剂盒曝光显影。利用Image J图像分析系统对条带进行分析和测量灰度值，以β-actin蛋白作为内参。

1.7 统计学方法 采用SPSS 13.0统计学软件进行分析。符合正态分布的计量资料用均数±标准差（±s）表示。多样本比较采用单因素方差分析，组间多重比较用SNK-q法，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NCTD抑制M14细胞增殖 CCK-8结果显示，NCTD可抑制黑素瘤M14细胞的增殖，药物作用24 h及48 h后各组的细胞生长抑制率差异有统计学意义（F分别为135.76、96.12，P＜0.05），经两两比较，各时点时50 μg/L与阴性对照（0 μg/L）组的抑制率差异无统计学意义，其余组间差异均有统计学意义（P＜0.05），见图1。

Fig.1 Effects of different concentrations of norcantharidin on the proliferation of melanoma M14 cells图1 不同浓度NCTD对黑素瘤M14细胞增殖的影响

2.2 NCTD诱导M14细胞凋亡情况 经NCTD处理过的细胞形态发生变化，轮廓不规整，胞核皱缩，体积变小，细胞黏附性差，漂浮细胞增多，见图2。DAPI染核后通过荧光显微镜观察，未经药物处理的细胞核形态正常，经药物处理过的细胞出现核固缩、核边集及凋亡小体，见图3。

Fig.2 The effect of different concentrations of norcantharidin on the morphology of melanoma M14 cells（×200）图2 倒置显微镜下观察不同浓度NCTD对黑素瘤M14细胞形态的影响（×200）

2.3 NCTD影响凋亡相关蛋白的表达 0、50、100及500 μg/L组凋亡抑制蛋白Bcl-2相对表达量依次为0.84±0.09、0.81±0.07、0.61±0.11、0.44±0.07，呈逐渐降低趋势（F=16.059，P＜0.05）。凋亡相关蛋白Bax相对表达量依次为0.04±0.01、0.52±0.05、0.71±0.06、0.82±0.09，呈逐渐升高趋势（F=139.822，P＜0.05），见图4。

Fig.3 Effect of different concentrations of norcantharidin on melanoma M14 cell nuclei under fluorescence microscope（DAPI，×AP0）图3 荧光显微镜下观察不同浓度NCTD对黑素瘤M14细胞核的影响（DAPI，×AP0）

3 讨论

恶性黑素瘤起源于神经外胚叶，近年来其发病率呈大幅度持续上升趋势，在女性中的增长速度仅次于肺癌，在男性则是肿瘤中增长速度最快的一型［6］。恶性黑素瘤大多数由黑痣恶变而来，原发病变90%在皮肤，多发生于头皮、颈部、手掌、小腿、足底、指（趾）等，也可发生在躯干皮肤，少数发生于皮肤以外的部位，如眼内、食管、直肠和肛门、阴道等。晚期黑素瘤对放疗和化疗不敏感，预后差，因此寻找治疗黑素瘤的有效药物是临床上亟待解决的问题，近年来美国FDA已陆续批准了干扰素［7］和免疫检查点抑制剂［3］等药物用于晚期黑素瘤的治疗，但远期疗效还有待于进一步观察。

斑蝥是我国的传统中药，斑蝥素是一种倍半萜类衍生物，是斑蝥抗癌的有效成分，然而斑蝥素可引起强烈的消化道反应，损伤肾功能。NCTD为斑蝥素的衍生物，是人工合成的一种新型抗癌药物，化学结构与斑蝥素相似［5］，目前已有研究表明，NCTD能显著抑制人皮肤鳞状细胞癌A431细胞的增殖、侵袭、黏附、迁移能力，其机制可能与下调血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、基质金属蛋白酶 2（matrix metalloproteinase 2，MMP-2）、MMP-9蛋白表达有关［8］；NCTD还能够抑制骨髓瘤U266细胞增殖，诱导细胞凋亡，认为可能与调控Notch信号通路有关［9］；此外，NCTD可通过阻滞细胞周期诱导肺腺癌A549［10］和胃癌SGC-7901细胞［11］凋亡；并通过抑制乳腺癌MCF-7细胞［12］血管生成能力而发挥抗肿瘤作用。然而其在黑素瘤中的作用尚鲜见报道。

Fig.4 The protein expressions of Bax and Bcl-2 in different groups of melanoma M14 cells图4 不同浓度NCTD对黑素瘤M14细胞Bax、Bcl-2蛋白表达的影响

本实验通过NCTD体外作用于人黑色素瘤M14细胞，应用CCK-8法证实了NCTD对黑素瘤细胞具有明显的生长抑制作用，并呈剂量依赖性。荧光显微镜下可见细胞核固缩、核边集及凋亡小体等细胞凋亡形态学改变，证实NCTD对人黑色素瘤M14细胞有抑制增殖作用，这与已发现的NCTD对骨髓瘤U266细胞、人肺腺癌A549细胞等的作用相同，说明NCTD确有抑制细胞增殖功能，但处理24、48 h时50 μg/L组与阴性对照组的抑制率差异无统计学意义，提示药物需达到较高浓度才能起效，其作用机制可能与促进细胞凋亡有关。Bcl-2和Bax是调控细胞凋亡的重要分子［13］。因此，结合上述研究，笔者认为NCTD可促进黑素瘤M14细胞中促凋亡分子Bax的表达，抑制抗凋亡分子Bcl-2的表达，由此可进一步诱导黑素瘤M14细胞的凋亡，推测NCTD诱导黑素瘤M14细胞凋亡的机制与促进Bax和抑制Bcl-2的表达有关。

综上所述，NCTD可有效抑制黑素瘤M14细胞增殖，其作用机制可能与促进细胞凋亡有关，NCTD有望成为辅助治疗恶性黑素瘤的药物之一。