LncRNA CCAT1通过PI3K/AKT信号通路影响子宫内膜癌细胞的增殖和凋亡①

李 林 刘 晶 王 景 杨 睿

(河北医科大学第一医院妇产科，石家庄 050000)

与其他恶性肿瘤一样，子宫内膜癌的发生是原癌基因活化和抑癌基因失活等因素相互作用的复杂而缓慢的过程，其发病机制尚不明确，深入研究子宫内膜癌的发病机制对预防其发生发展、早期诊断、靶向治疗等具有积极作用[1，2]。LncRNA CCAT1在乳腺癌、卵巢癌等多种恶性肿瘤中高表达，被认为是一种致癌基因，在多种恶性肿瘤的发生发展中具有重要作用[3，4]。关于LncRNA CCAT1在子宫内膜癌中的研究较少，Yu等[5]研究发现CCAT1在子宫内膜癌组织和子宫内膜癌细胞中表达上调。但LncRNA CCAT1通过何种机制在子宫内膜癌发生发展中发挥作用尚不清楚。磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信号通路在子宫内膜癌细胞的增殖和凋亡中发挥重要作用，参与子宫内膜癌的发生发展。本文对CCAT1对子宫内膜癌细胞增殖、凋亡和PI3K/AKT信号通路的影响进行研究，探讨CCAT1在子宫内膜癌生长中的可能作用机制。

1 材料与方法

1.1材料 人子宫内膜癌细胞珠HEC-1-A和正常人子宫内膜基质细胞系T-HESC(中国科学院上海细胞库)；逆转录试剂盒、PCR试剂盒、TRIzol试剂、细胞凋亡检测试剂盒、ECL化学发光试剂盒(美国Sigma公司)；胰蛋白酶、CCK8试剂、DMEM培养基(美国BPB公司)；兔抗人增殖细胞核抗原(PCNA)单克隆抗体、兔抗人活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cleaved caspase 3)单克隆抗体、兔抗人Bcl-2相关X蛋白(Bax)单克隆抗体、兔抗人B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)单克隆抗体、兔抗人PI3K单克隆抗体、兔抗人AKT单克隆抗体、兔抗人磷酸化AKT(p-AKT)单克隆抗体(美国Santa Cruz公司)；Lipofectamine 2000试剂盒(美国Invitrogen公司)；CCAT1模拟物siRNA(CCAT1-siRNA)和NC模拟物siRNA(NC)(广州博锐生物科技公司)；PCR扩增仪(美国Gibco公司)；iNark酶标仪和ZE5流式细胞仪(美国Bio-Rad公司)。

1.2方法

1.2.1RT-PCR测定HEC-1-A和T-HESC细胞中CCAT1水平 TRIzol法提取HEC-1-A和T-HESC细胞总RNA ，分光光度计测定HEC-1-A和T-HESC细胞RNA浓度和纯度。将RNA逆转录为cDNA，以U6为内参，PCR测定HEC-1-A和T-HESC细胞中CCAT1水平，CCAT1上游引物：5′-CCATTCCATTCATTTCTCTTTCCTA-3′，下游引物：5′-GGCGTAGGCGATTGGGGATCG-3′。PCR反应条件为95℃ 20 s；95℃ 10 s，56℃ 30 s，共38个循环。每组设7个复孔。CCAT1水平以2-ΔΔCt表示。

1.2.2细胞分组和转染 取对数生长期HEC-1-A细胞，分为空白对照组(BC)、阴性对照组(NC)和CCAT1-siRNA组，根据Lipofectamine 2000试剂盒说明书转染。取各组对数生长期的HEC-1-A细胞接种于6孔板(2×105个/孔)培养24 h，待细胞生长至85%以上融合时进行转染，CCAT1-siRNA组转染CCAT1-siRNA，NC组转染阴性对照siRNA，BC组不转染。转染48 h后RT-PCR测定转染效率(即各组HEC-1-A细胞中CCAT1水平)，方法同1.2.1。

1.2.3CCK8测定HEC-1-A细胞增殖 取生长良好的各组细胞接种于96孔板(5×103个/孔)，分别在培养24、48、72 h时加入CCK8试剂(10 μl/孔)，继续培养2 h，酶标仪测定各孔细胞光密度(OD)值。每组设7个复孔。

1.2.4流式细胞术测定HEC-1-A细胞凋亡 取各组转染48 h的细胞，经胰蛋白酶消化后，将细胞浓度调整为3×104个/ml，2 000 r/min离心10 min，PBS洗涤，75%乙醇处理后加入Binding Buffer缓冲液200 μl重悬细胞，再加入5 μl膜联蛋白-V-异硫氰酸荧光素(Annexin-V-FITC)和10 μl碘化丙啶处理30 min，流式细胞术测定HEC-1-A细胞凋亡率。

1.2.5Western blot测定HEC-1-A细胞PCNA、clea-ved caspase 3、Bax、Bcl-2、PI3K、AKT、p-AKT蛋白水平 取转染48 h的各组细胞，加入蛋白裂解液提取HEC-1-A细胞总蛋白，BCA法测定HEC-1-A细胞蛋白浓度。取100 μg上清蛋白进行电泳、转膜，5%脱脂奶粉封闭，分别加入兔抗人PCNA单克隆抗体、兔抗人cleaved caspase 3单克隆抗体、兔抗人Bax单克隆抗体、兔抗人Bcl-2单克隆抗体、兔抗人PI3K单克隆抗体、兔抗人AKT单克隆抗体、兔抗人p-AKT单克隆抗体，稀释比例1∶ 300，孵育过夜。加入二抗(1∶ 5 000)孵育2 h，化学发光法显色，以β-actin为内参，采用凝胶电泳成像仪采集图像，Quantity One软件分析各蛋白条带灰度值。目标蛋白水平以目标蛋白条带灰度值/β-actin条带灰度值表示。

2 结果

2.1CCAT1在HEC-1-A细胞中的表达 HEC-1-A细胞中CCAT1水平(2.15±0.24)高于T-HESC细胞(1.00±0.13)(t=11.147，P<0.001)。见图1。

2.2CCAT1-siRNA对HEC-1-A细胞的转染效率 与BC组和NC组相比，CCAT1-siRNA组HEC-1-A细胞中CCAT1水平降低(P<0.05)，BC组和NC组HEC-1-A细胞中CCAT1水平差异无统计学意义(P>0.05)。见表1、图2。

2.3CCAT1-siRNA对HEC-1-A细胞增殖的影响 24 h时3组HEC-1-A细胞增殖率差异无统计学意义(P>0.05)；48 h和72 h时与BC组和NC组相比，CCAT1-siRNA组HEC-1-A细胞中增殖率降低(P<0.001)，BC组和NC组HEC-1-A细胞增殖率差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

2.4CCAT1-siRNA对HEC-1-A细胞凋亡的影响 与BC组和NC组相比，CCAT1-siRNA组HEC-1-A细胞凋亡率升高(P<0.05)，BC组和NC组HEC-1-A细胞凋亡率差异无统计学意义(P>0.05)。见表1、图3。

图1 HEC-1-A和T-HESC细胞中CCAT1水平Fig.1 CCAT1 levels in HEC-1-A and T-HESC cellsNote:Compared with HEC-1-A group,*.P<0.05.

表1 各组HEC-1-A细胞CCAT1水平和细胞凋亡率

2.5CCAT1-siRNA对HEC-1-A细胞增殖凋亡相关蛋白的影响 与BC组和NC组相比，CCAT1-siRNA组HEC-1-A细胞中PCNA和Bcl-2蛋白水平降低(P<0.001)，cleaved caspase 3和Bax蛋白水平升高(P<0.001)，BC组和NC组HEC-1-A细胞中PCNA、cleaved caspase 3、Bax、Bcl-2蛋白水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表3、图4。

2.6CCAT1-siRNA对HEC-1-A细胞PI3K/AKT信号通路的影响 3组HEC-1-A细胞AKT蛋白水平比较差异无统计学意义(P>0.05)；与BC组和NC组相比，CCAT1-siRNA组HEC-1-A细胞中PI3K和p-AKT蛋白水平降低(P<0.001)，BC组和NC组HEC-1-A细胞中PI3K和p-AKT蛋白水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表4、图5。

表2 各组HEC-1-A细胞增殖率比较

图3 各组HEC-1-A细胞凋亡Fig.3 Apoptosis of HEC-1-A cells in each groupNote:Compared with BC group,*.P<0.05,compared with NC group,#.P<0.05.

图4 各组HEC-1-A细胞PCNA、cleaved caspase 3、Bax、Bcl-2蛋白表达Fig.4 Expressions of PCNA,cleaved caspase 3,Bax and Bcl-2 proteins in HEC-1-A cells of each groupNote:1.BC group；2.NC group；3.CCAT1-siRNA group.

表3 各组HEC-1-A细胞PCNA、cleaved caspase 3、Bax、Bcl-2蛋白水平比较

表4 各组HEC-1-A细胞PI3K、AKT、p-AKT蛋白水平比较

图5 各组HEC-1-A细胞PI3K、AKT、p-AKT蛋白Western blot电泳图Fig.5 Western blot analysis of PI3K，AKT and p-AKT proteins in HEC-1-A cells of each groupNote:1.BC group；2.NC group；3.CCAT1-siRNA group.

3 讨论

LncRNA空间结构多样、序列长、功能复杂，可以从表观遗传、转录调控和转录后调控3个层面调控基因表达[6]。LncRNA可影响细胞的增殖和凋亡信号通路，影响恶性肿瘤的侵袭和转移，在恶性肿瘤的发生发展中发挥重要作用[7]。目前发现多种LncRNA与恶性肿瘤关系密切，根据LncRNA在恶性肿瘤发生发展及侵袭迁移中的作用分为促进肿瘤发生的LncRNA和抑制肿瘤发生的LncRNA[8]。LncRNA CCAT1最早在结肠癌组织中被发现明显升高，可通过升高N-钙黏素水平和降低E-钙黏素水平促进上皮细胞间质转化，导致细胞极性丢失，从而促进结直肠癌的发生发展[9]。后来研究发现CCAT1在多种恶性肿瘤中表达异常，并通过多种信号通路参与恶性肿瘤的发生发展[10-12]。余南荣等[13]研究发现LncRNA CCAT在胃癌组织和胃癌细胞中高表达，抑制LncRNA CCAT表达通过丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路诱导胃癌细胞周期停滞，促进胃癌细胞凋亡，抑制胃癌细胞的侵袭和迁移。CCAT在子宫内膜癌中的作用也受到广泛关注，Yu等[5]研究发现子宫内膜癌细胞中CCAT1水平升高，敲低子宫内膜癌细胞中CCAT1水平可通过miR-181a-5p抑制子宫内膜癌增殖和迁移。本文通过沉默子宫内膜癌细胞HEC-1-A中CCAT1水平，发现沉默子宫内膜癌细胞中CCAT1水平可抑制子宫内膜癌细胞增殖、促进细胞凋亡。本研究结果和Yu等[5]的研究结果一致，表明CCAT1可能在子宫内膜癌的发生发展中发挥重要作用，但其在子宫内膜癌中的作用机制尚不明确。

细胞的增殖和凋亡失调是引起子宫内膜癌发生发展的重要原因，子宫内膜癌细胞增殖和凋亡受多种信号通路调控。PI3K/AKT通路是细胞内重要的信号转导通路，在子宫内膜癌的发生发展中发挥重要作用[14]。研究发现子宫内膜癌中PI3K/AKT通路激活，促进子宫内膜癌的发生发展，抑制PI3K/AKT通路激活可抑制子宫内膜癌的发生发展[15，16]。PI3K/AKT信号通路下游有多种效应分子，其中AKT是该通路下游的直接底物，磷酸化的AKT可促进子宫内膜癌细胞的增殖、抑制细胞凋亡，增强细胞的运动能力[17]。

LncRNA CCAT1可通过多种信号通路参与恶性肿瘤的发生发展，Yang等[18]研究发现CCAT1在甲状腺癌细胞中表达上调，其可通过激活PI3K/AKT信号通路促进甲状腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移，推测CCAT1可能通过PI3K/AKT信号通路参与子宫内膜癌的发生发展。本研究表明沉默LncRNA CCAT1可降低子宫内膜癌细胞中PCNA、Bcl-2、PI3K和p-AKT蛋白水平，提高cleaved caspase 3和Bax蛋白水平。PCNA在恶性肿瘤细胞和增殖细胞中存在，和细胞DNA合成关系密切，是细胞异常增殖的关键蛋白，在子宫内膜癌等恶性肿瘤中高表达，可反映子宫内膜癌细胞的增殖情况[19]。Bcl-2为抑癌基因，具有抑制细胞凋亡的作用[20]。Bax为Bcl-2家族基因，为人体主要的凋亡基因，对Bcl-2起抑制作用，为重要的促细胞凋亡基因[21]。Caspase途径在恶性肿瘤细胞凋亡中发挥重要作用，caspase 3为其级联反应下游的主要蛋白酶，在恶性肿瘤细胞凋亡的调节中发挥主导作用，为死亡执行蛋白酶，caspase 3活化后可使细胞凋亡进入不可逆阶段，是恶性肿瘤细胞凋亡的重要指标[22]。本研究沉默LncRNA CCAT1后子宫内膜癌细胞中PCNA、Bcl-2蛋白水平降低，cleaved caspase 3和Bax蛋白水平升高，表明沉默LncRNA CCAT1可抑制子宫内膜癌细胞增殖、促进凋亡。沉默CCAT1后子宫内膜癌细胞中PI3K和p-AKT蛋白水平降低，表明沉默CCAT1可抑制子宫内膜癌细胞PI3K/AKT信号通路激活。推测沉默CCAT1可能通过抑制PI3K/AKT信号通路抑制子宫内膜癌细胞增殖、促进细胞凋亡。

综上所述，LncRNA CCAT1参与子宫内膜癌的发生发展，其机制可能与LncRNA CCAT1可影响PI3K/AKT信号通路的激活有关。