钆喷替酸葡甲胺对软骨细胞凋亡及自噬的影响

焦华杰，宋 涛，于 芝，王琰娟，饶慧敏

随着核磁共振(MR)技术的发展及其影像学诊断独特的优势，目前MR在临床的应用越来越广泛。钆喷替酸葡甲胺是常用的MR扫描对比剂，长期以来被认为在推荐剂量下是安全的,然而越来越多的证据表明，钆并不能完全从体内清除,一些钆剂持续存在于人体组织细胞中[1]。MR直接法关节造影在关节损伤诊断方面应用广泛[2]，但对比剂钆喷替酸葡甲胺局部注射对关节软骨细胞是否会产生毒性影响，目前尚无文献资料报道。本研究通过细胞实验探讨不同剂量钆喷替酸葡甲胺对人软骨细胞的毒性及对人软骨细胞凋亡及自噬的影响。

1 资料与方法

1.1 细胞培养及分组:人软骨细胞购自北纳生物，细胞培养采用DMEM/F12培养基+10胎牛血清+1%双抗(青霉素+链霉素)，细胞每48h换液一次，细胞融合达到80%进行传代培养,bcl2兔抗人蛋白抗体(12789-1-AP)、bax兔抗人抗体(50599-2-Ig)、lc3兔抗人抗体(14600-1-AP)、p62兔抗人抗体(18420-1-AP)、gapdh兔抗人抗体(10494-1-AP)购自武汉三鹰公司，cleaved-caspase3兔抗人抗体(9661)购自CST公司。实验依据加入药物浓度分为正常对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组，各组细胞培养液中分别加入0 mmoL/L、0.5 mmoL/L、2 mmoL/L、10 mmoL/L钆喷替酸葡甲胺。

1.2 CCK8细胞增殖检测:取对数生长期软骨细胞，接种到96孔板中，每孔104个细胞，分别加入对应浓度药物24 h 后，CCK8检测各组细胞增殖率，每组重复3次。

1.3 细胞凋亡率检测:取对数生长期软骨细胞，分别加入对应浓度的钆喷替酸葡甲胺24h后，0.25%胰酶消化收集细胞，PBS离心洗涤3次(800 g，5 min，下同)，75%乙醇固定30 min，PBS离心洗涤3次，加入500 μL凋亡检测工作液。避光孵育30 min后流式细胞仪检测各组细胞凋亡率，每组重复3次。

1.4 Western blot检测:各组细胞，0.25%胰酶消化后，PBS离心洗涤3次，加入500 μL预配置好的细胞裂解液，冰上裂解5 min，震荡10 s，反复操作5次，12 000 g离心15 min，收集上清，BCA法检测蛋白浓度，加热煮沸5 min，配制SDS凝胶，每组加入30 μg蛋白，110 V恒压电泳，300 mA恒流转膜，5%脱脂奶粉封闭1 h，加入一抗工作液37 ℃孵育1 h(bcl2兔抗人抗体，1∶2 000；bax兔抗人抗体，1∶5 000；cleaved-caspase3兔抗人抗体,1∶1 000；lc3兔抗人抗体,1∶3 000；p62兔抗人抗体,1∶4 000；gapdh兔抗人抗体,1∶20 000)，TBST洗膜3次，加入二抗( HRP标记山羊抗兔二抗,1∶10 000)工作液37 ℃孵育1 h，TBST洗涤3次，ECL发光检测，采用ImageJ软件进行蛋白表达相对定量。

2 结果

2.1 CCK8细胞增殖检测:各组细胞增殖检测比较(F=7.350,P<0.05)，组间两两比较低剂量组(1.01±0.04)与正常对照组细胞(0.99±0.06)增殖率比较差异无统计学意义(t=0.507,P>0.05)，中剂量组(0.97±0.05)与正常对照组细胞(0.99±0.06)增殖率比较差异无统计学意义(t=1.144，P>0.05)，高剂量组(0.86±0.015)，与正常对照组比较，差异具有统计学意义(t=6.784，P<0.05)。

2.2 各组细胞凋亡率检测:正常对照组细胞凋亡率为(1.17±0.15)%，低剂量组为(1.27±0.16)%，中剂量组为(1.20±0.20)%，高剂量组为(5.01±0.25)%，四组比较差异有统计学意义(F=297.44,P<0.05)。各组细胞凋亡率检测比较，低剂量组、中剂量组细胞凋亡率与正常对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)，高剂量组与正常对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3 各组细胞凋亡蛋白表达相对定量比较:Western blot检测各组细胞凋亡蛋白表达，低剂量组、中剂量组与正常对照组比较，bcl2、bax、cleaved-caspase3蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)，高剂量组与正常对照组比较，bcl2蛋白表达下调，bax、cleaved-caspase3蛋白表达上调，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 各组细胞凋亡蛋白表达相对定量比较

2.4 各组细胞自噬蛋白表达比较:Western blot检测各组细胞自噬蛋白表达，低剂量组、中剂量组与正常对照组比较，lc3Ⅱ蛋白表达上调，差异有统计学意义(P<0.05)，p62蛋白表达下调，差异有统计学意义(P<0.05)；高剂量组与正常对照组比较，lc3Ⅱ蛋白表达下调，lc3 、p62蛋白表达上调，差异有统计学意义(P<0.05),见表2。

表2 各组细胞自噬蛋白相对表达定量比较

3 讨论

近年来MR关节造影在临床应用越来越多，相关研究表明MR 关节造影对半月板撕裂的敏感性和特异性有明显提高，检查结果更接近关节镜[3]。MR关节造影分为直接法和间接法，直接法是先向关节腔内注射MR对比剂，然后通过MR扫描观察关节结构及病变。直接法膝关节MR造影可以通过扩大分离关节囊,能够更加清晰显示关节内部结构及病变，同时对于某些膝关节病变,如评价术后半月板是否再次损伤、膝关节游离体、评价关节软骨退变、剥脱等方面,MR膝关节直接造影具有很高的诊断价值[4]。

钆喷替酸葡甲胺是常用的MR扫描对比剂，随着研究的不断深入，近年来关于钆增强剂应用的安全性越来越受到关注[5]，MR增强扫描后的组织细胞钆沉积对机体具有一定危害[6-7]，同时有相关资料显示钆可在细胞中长期存在[8-9]。有研究表明[10]，小鼠孕期接受钆增强剂可同过胎盘沉积于幼鼠大脑组织，并对幼鼠脑发育产生影响。Beyazal Celiker F等研究表明临床反复使用钆对比剂可使大鼠睾丸间质细胞凋亡增加，血清Ca2+水平升高，睾酮水平降低[11]。

骨组成细胞包括软骨细胞、成骨细胞和骨细胞的细胞死亡，在骨骼的发育、维持和修复以及骨关节炎和骨质疏松的发病机制中起着重要作用。软骨细胞的增殖、分化和凋亡是软骨内成骨的重要步骤,软骨细胞通过产生各种酶、细胞因子和基质相关蛋白来维持细胞外基质在降解和修复之间的功能平衡[12]，而广泛的软骨细胞死亡或功能障碍可导致关节损伤的进一步发展[13]。为此，在关节损伤诊断治疗过程中应尽力保护关节软骨细胞数量功能完整。

目前国内外常用钆喷替酸葡甲胺关节造影浓度为0.5 mmoL/L及2 mmoL/L[14]，也有文献资料表明可应用到45 mmoL/L[15]。本次研究中通过比较不同浓度钆喷替酸葡甲胺对人软骨细胞增殖、凋亡影响发现，0.5 mmoL/L、2 mmoL/L钆喷替酸葡甲胺对软骨细胞增殖及凋亡无影响，但可促进细胞自噬相关蛋白lc3Ⅱ表达，提高细胞自噬能力。10 mmoL/L钆喷替酸葡甲胺能够抑制人软骨细胞增殖及自噬，通过上调促凋亡蛋白bax、cleaved-caspase3蛋白表达，抑制抗凋亡蛋白bcl2表达进而促进软骨细胞凋亡。

综上所述，本次研究表明低浓度钆喷替酸葡甲胺能够促进人软骨细胞自噬，而高浓度钆喷替酸葡甲胺能够抑制人软骨细胞增殖及自噬，促进软骨细胞凋亡。虽然本次研究对钆喷替酸葡甲胺诱导人软骨细胞凋亡的机制尚未阐明，但本次研究结果为临床改善钆喷替酸葡甲胺进行MR关节造影提供了理论依据，临床医师在进行MR关节造影检查时应严格把控钆喷替酸葡甲胺对比剂浓度，避免高浓度对比剂带来的二次损伤。