Roche定量试剂和国产PCR试剂检测HBV—DNA的比较分析

周美英+高国生+胡爱荣

[摘要] 目的 探討Roche定量试剂和国产PCR试剂检测慢性HBV感染者血清HBV-DNA的差异。 方法 收集慢性HBV感染患者366例，包括慢性乙型肝炎患者247例，乙肝肝硬化失代偿患者72例，乙肝相关性肝癌患者28例，乙型慢加急性肝衰竭患者19例；采用Roche定量试剂（试剂A）和和国产PCR试剂（试剂B）检测患者血清HBV-DNA，比较检测结果的差异、相关性及影响因素。 结果 试剂B 124例（33.88%）低于检测下限而试剂A高于检测下限（包括24例超过1.00×103 IU/mL，考虑试剂B为假阴性）；试剂A的阳性率（70.49%）显著高于试剂B（36.61%）（P<0.01）。试剂A的HBV-DNA检测均值高于试剂B（P<0.05），HBeAg滴度低者、终末期患者更容易出现COBAS系统的血清HBV-DNA检测值高于国产试剂的情况。Spearman相关分析显示，两种试剂在1.00×103 IU/mL

[关键词] 乙型肝炎病毒；COBAS Taqman系统；荧光定量PCR

[中图分类号] R446.1 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2017）34-0114-04

Comparative analysis of Roche quantitative reagent and domestic PCR reagent for detection of HBV-DNA

ZHOU Meiying1 GAO Guosheng2 HU Airong3

1.Center Laboratory，Zhejiang Taizhou Hospital，Taizhou 317000，China；2.Department of Clinical Laboratory，Ningbo City Second Hospital，Ningbo 315010，China；3.Department of Liver Diseases，Ningbo City Second Hospital，Ningbo 315010，China

[Abstract] Objective To investigate the difference in detecting serum HBV-DNA of chronic HBV infection patients between Roche quantitative reagent and domestic PCR reagent. Methods 366 patients with chronic HBV infection were collected， including 247 patients with chronic hepatitis B， 72 patients with decompensated liver cirrhosis， 28 patients with hepatitis B-related hepatocellular carcinoma and 19 patients with acute-on-chronic liver failure. Roche quantitative reagent（reagent A）and domestic PCR reagent（reagent B）were used to detect the serum HBV-DNA. And the difference of the detection results， the correlation and influencing factors between the two reagents were compared. Results There were 124 cases（33.88%） which were below the detection limit detected by reagent B and above the detection limit detected by reagent A， including 24 cases more than 1.00×103 IU/mL， considering reagent B as false negative. The positive rate of reagent A（70.49%） was significantly higher than that of reagent B（36.61%）（P<0.01）. The detection mean values of HBV-DNA by reagent A was higher than those of reagent B（P<0.05）. The patients with lower HBeAg titers， end-stage were more prone to appear the situation that the serum HBV-DNA of the COBAS system was higher than that of the domestic reagent. Spearman correlation analysis showed that the correlation was better when two reagents were in the 1.00×103 IU/mL

[Key words] Hepatitis B virus； COBAS Taqman system； Fluorescence quantitative PCR

我国是乙型肝炎病毒（HBV）感染的高流行地区，其中1～59岁普通人群乙肝表面抗原的携带率约为7.18%[1]。HBV-DNA的检测对于HBV相关疾病的诊断与治疗均十分重要[2]，目前国内医疗机构多采用国产PCR试剂，而国际“金标准”是Roche公司的COBAS AmpliPrep-COBAS TaqMan实时荧光PCR定量检测试剂盒，这两种试剂在敏感性、准确性、重复性、线性范围等方面均存在差异[3-4]。在实际临床工作中，对于如何评价、选择和使用HBV-DNA检测仍存在一些理解不到位的地方，由此可能导致误诊、误治。本文从多个角度对国产PCR试剂和Roche定量试剂检测HBV-DNA作比较分析，为临床合理、正确地应用相应试剂检测HBV-DNA提供实验依据。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2013年12月～2015年10月在本院肝病中心就诊的慢性HBV感染患者366例，包括247例慢性乙型肝炎（CHB）患者，72例乙肝肝硬化失代偿患者，28例乙肝相关性肝癌患者，19例乙型慢加急性肝衰竭患者，后三者归为终末期肝病。其中男261例，女105例；年龄5～81岁，平均（43.94±12.96）岁，所有患者诊断标准依据《慢性乙型肝炎防治指南》（2015版）[5]。HBV感染患者均为单一HBV感染，排除其他肝炎病毒或原因引起的肝病。

1.2 方法

所有患者标本同时用两种试剂（或方法）检测HBV-DNA，试剂A采用Roche COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan 48系统的配套试剂；试剂B由国内某公司生产的荧光定量PCR试剂（为避免商业利益纠纷，以试剂B替代其名称），检测仪器采用美国ABI 7500型荧光定量PCR仪。根据检测结果分为两组，A组为试剂A的检测值高于试剂B，B组为B的检测值高于试剂A。

1.3 统计学方法

采用SPSS 16.0统计软件进行处理。正态分布计量资料以均数±标准差表示，两组比较采用t检验；偏态分布计量资料采用M（Q25，Q75）表示，两组比较采用Mann-Whitney U非参数检验；计数资料比较采用χ2检验；采用Spearman相关分析两种试剂（或方法）检测HBV-DNA的相关性。P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 两种试剂的基本特征比较

试剂A的HBV-DNA检测值范围20.9～>1.70×108 IU/mL，试剂B的HBV-DNA检测值范围617.00～5.62×108 IU/mL。其中108例（29.51%）A、B两种试剂均低于检测下限，124例（33.88%）试剂B低于检测下限而试剂A高于检测下限（包括24例超过1.00×103 IU/mL，考虑试剂B为假阴性），134例（36.61%）检测结果均高于两种方法的检测下限。试剂A的阳性率为70.49%，试剂B的阳性率为36.61%，两者差异有统计学意义（χ2=84.45，P<0.01）。

2.2两种试剂HBV-DNA检测值的比较及影响因素

全部患者试剂A的HBV-DNA检测均值为（2.85±2.57）Log10 IU/mL，试剂B的HBV-DNA检测均值为（1.89±2.67）Log10 IU/mL，试剂A的检测均值显著高于试剂B（t=12.47，P<0.01）。试剂A的检测值高于试剂B 204例（A组），试剂B的检测值高于试剂A 46例（B组，其中4例试剂A的检测值报告形式>1.70×108 IU/mL故予以剔除），其余112例试剂A、B的检测值相同（包括108例A、B两种试剂均低于检测下限、4例检测值完全一致）；组别A和B的HBeAg滴度、终末期患者比例差异均有统计学意义（U=1305.00、χ2=6.42，P<0.05），而性别比例、年龄和ALT水平差异无统计学意义（χ2=0.31，t=1.07，U=4350.00，P>0.05），见表1。

2.3两种试剂的相关性分析

以试剂A为标准，Spearman相关分析显示，1.00×103 IU/mL0.70），见表2。

3讨论

传统的HBV血清标志物如HBsAg、HBeAg等是病毒感染和复制的间接指标，但其受病毒变异、患者免疫状态等多种因素的影响，而血清HBV-DNA定量则更为直接，可以反映患者体内病毒复制活动情况。血清HBV-DNA的检测一般基于荧光定量聚合酶链反应或多聚酶链反应（PCR），该技术自上世纪80年代逐步发展起来，具有敏感、特异、快速、简便、重复性好、易于自动化、定量范围宽等优点。国内有多个品牌的PCR试剂盒，但诸如核酸的提取、标本的状态、退火温度、引物的设计等均没有标准化[6]，故检测结果之间存在差异。COBAS AmpliPrep-COBAS TaqMan实时荧光PCR定量检测试剂盒由美国食品与药品监督管理局（FDA）批准，由于增加进入检测体系的样品容积（达到650 μL，远高于国产试剂盒的50～100 μL）可以显著提高敏感度、采用全自动的核酸提取系统并通过磁珠吸附法纯化可以有效提取核酸、设置了内参故可以有效弥补标本间核酸提取效率的差异及反应体系中可能存在的抑制物质的影响、采取多对覆盖高变区的引物探针可以避免由于病毒变异导致的假阴性，故一般认为其灵敏度、准确度、重复性等较国产试剂更好[3-4，7-8]。

本研究结果表明，COBAS系统有更灵敏的检测下限，血清HBV-DNA的最小准确检测值可达20.93 IU/mL，但其检测上限（1.70×108 IU/mL）稍逊于国产试剂（5.62×108 IU/mL），与既往的报道基本一致[9-10]。而且共366例患者中有124例（33.88%）出现两种方法的检测结果明显不一致，全都为国产试剂低于检测下限而COBAS系统高于检测下限。邵国辉等[11]分析了112份经国产试剂检测结果低于检测下限的拟停药乙肝患者血清标本，经COBAS系统再次检测有72例（64.29%）高于高灵敏度HBV-DNA检测下限（20 IU/mL），与本研究的结论基本相似（甚至有更高的比例）。需要指出的是，本研究中还有24例患者超过1.00×103 IU/mL，而这些患者可能为国产试剂假阴性的表现。陈占国等[12]认为由于近年来抗病毒药物的广泛使用，由于病毒变异导致試剂对突变的HBV存在检测盲区或效率低下，出现假阴性的概率逐年增加，这在一定程度上解释了本文的分析结果。因此，COBAS系统检测HBV-DNA的阳性率也显著高于国产试剂，张玥等[13]也有类似的报道。故在临床实际工作中，对于那些慢性HBV感染患者多次国产试剂检测血清HBV-DNA<1.00×103 IU/mL而无明确其他肝损原因、接受抗病毒治疗后血清HBV-DNA长期<1.00×103 IU/mL，但血清ALT、AST持续异常者均有必要采用COBAS系统予以复查确认病毒的真正复制状态并排除由于试剂原因导致的假阴性。

临床上，HBV-DNA检测结果的假阴性会延误部分患者的抗HBV治疗的时机。对失代偿期肝硬化患者抗病毒治疗，我国指南提出只要HBV-DNA可检测到，就可应用核苷（酸）类似物进行治疗，与2009年版AASLD指南的观点一致[1，14]。另外《慢性乙型肝炎抗病毒治疗专家共识》指出[15]，对年龄超过40岁或有肝硬化、肝细胞癌家族史的慢乙肝患者，也有同样的建议。但因应用国产试剂检测下限HBV-DNA<1.00×103 IU/mL，将导致一部分患者不能得到及时治疗。本研究证实了这一点，以1.00×103 IU/mL作为HBV-DNA检测下限，将有27.32%（100/366）的患者不能得到及时的抗病毒治疗，这将增加该部分患者病情进展的风险。

进一步的分析发现，COBAS系统的血清HBV-DNA检测均值显著高于国产试剂，通过配对比较发现366例患者中，204例试剂A的检测值高于试剂B，只有50例试剂B的检测值高于试剂A，与部分学者[9，16]的观点基本一致，表明COBAS系统的平均扩增效率优于国产试剂，且本研究还发现HBeAg滴度低者、终末期肝病患者更容易出现COBAS系统的血清HBV-DNA检测值高于国产试剂的情况，其中缘由可能与此类患者体内乙肝病毒变异率高有关，故此时宜选用COBAS系统检测血清HBV-DNA方可更准确地反应机体内病毒复制情况。

两种试剂的相关性分析表明，在HBV-DNA<1.00×103 IU/mL时相关性较差，与倪俊明等[17-19]研究结果一致，这可能与部分患者在低病毒载量时国产试剂难以检测出病毒复制水平有关；而在高水平复制状态时（>1.00×107 IU/mL）由于COBAS系统的检测上限限制，两种试剂的相关性也较差。但在1.00×103 IU/mL

总之，国产PCR试剂可以用于抗病毒治疗的随访、监测，基本满足临床的需求，但其灵敏性、准确性相较COBAS系统仍有差距，特别是针对那些怀疑有低病毒复制状态或病毒变异导致国产PCR试剂假阴性的患者，更有必要用COBAS系统予以复核。同时，由于本文病例的选择并非完全随机，故确切结论仍需大样本、多中心的数据予以验证。

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（收稿日期：2017-08-11）