急腹症Ⅲ号对呼吸机相关性肺炎大鼠肠道通透性及细菌移位的影响

王瑞明

[摘要] 目的 觀察急腹症Ⅲ号对呼吸机相关性肺炎模型大鼠肠黏膜屏障的影响，并探讨其作用机制。 方法 选择清洁型雄性SD大鼠100只，随机分为5组。急腹症Ⅲ号组：VAP（呼吸机相关性肺炎）模型，每日灌胃急腹症Ⅲ号2 mL；谷氨酰胺组：VAP模型，每日灌胃谷氨酰胺颗粒2 mL；急腹症Ⅲ号联合谷氨酰胺组：VAP模型，每日灌胃急腹症Ⅲ号及谷氨酰胺颗粒各2 mL；安慰剂组：VAP模型，每日灌胃生理盐水2 mL；空白对照组：无特殊处理，每日灌胃生理盐水2 mL。术后第5天收集尿液，采用乳果糖/甘露醇法评价肠黏膜通透性，第6天处死大鼠取肠系膜淋巴结进行培养。 结果 肠道通透性方面，安慰剂组较空白对照组L/M（乳果糖/甘露醇）明显增大（P<0.05），其余三个干预组与空白对照组相似，急腹症Ⅲ号组L/M大于谷氨酰胺组，但差异无统计学意义。细菌移位方面，安慰剂组明显高于空白对照组（P<0.01），其余三组阳性率均低于安慰剂组（P<0.05）。培养结果主要为肠道寄生菌（大肠杆菌为主）。 结论 呼吸机相关性肺炎模型破坏了大鼠的小肠黏膜结构并增加了肠道通透性，出现肠道细菌移位。院内制剂急腹症Ⅲ号可使肠黏膜通透性减小，促进肠黏膜结构修复，减少肠道菌群移位。谷氨酰胺和急腹症Ⅲ号联合使用对肠道黏膜结构保护作用并没有更加明显。

[关键词] 急腹症Ⅲ号；呼吸机相关性肺炎；肠道通透性；细菌移位

[中图分类号] R563 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2017）34-0020-04

Effect of acute abdomen Ⅲ on intestinal permeability and bacterial translocation in ventilator-associated pneumonia rats

WANG Ruiming

Department of Emergency Medicine， Hangzhou Traditional Chinese Medicine Hospital， Hangzhou 310007， China

[Abstract] Objective To observe the effect of acute abdomen Ⅲ on intestinal mucosal barrier in ventilator-associated pneumonia model rats and to explore its mechanism. Methods A total of 100 clean male Sprague-Dawley rats were randomly divided into 5 groups. The acute abdomen group Ⅲ group： VAP（ventilator-associated pneumonia） model， daily gavage of acute abdomen Ⅲ 2 mL； glutamine group： VAP model， daily gavage of glutamine particles 2 mL； acute abdomen Ⅲ combined with glutamine group： VAP model， daily gavage of acute abdomen Ⅲ 2 mL and glutamine particles 2 mL； placebo group： VAP model， daily intake of saline 2 mL； blank control group： No special treatment， daily gavage of saline 2 mL. The urine was collected on the fifth day after operation. The permeability of intestinal mucosa was evaluated by lactulose/mannitol method. The rats were sacrificed on the 6th day and mesenteric lymph nodes were cultured. Results The intestinal permeability of the placebo group was significantly higher than that of the blank control group L/M （lactulose/mannitol）（P<0.05）. And the intestinal permeability of the other three intervention groups was similar to that of the blank control group. And L/M in the acute abdomen Ⅲ group was higher than that of the glutamine group， but there was no significant difference. The placebo group had significantly higher bacterial translocation than that of the blank control group（P<0.01）. The positive rate of bacterial translocation in the remaining three groups was lower than that of the placebo group（P<0.05）. The culture results were mainly intestinal parasites （Escherichia coli）. Conclusion Ventilator-associated pneumonia model destroys the intestinal mucosa of rats and increases intestinal permeability， resulting in intestinal bacterial translocation. In-hospital preparation of acute abdomen Ⅲ can reduce intestinal mucosal permeability， promote intestinal mucosal repair and can reduce intestinal bacterial translocation. The combination use of Glutamine and acute abdomen Ⅲ has no more obvious protection role in intestinal mucosal structure.endprint

[Key words] Acute abdomen Ⅲ； Ventilator-associated pneumonia； Intestinal permeability； Bacterial translocation

肠道被认为是危重病应激的“中心器官”和MODS的“始动器”[1]。肠道黏膜屏障是人体抵御外界细菌入侵的重要屏障，但因其本身存在大量细菌，所以又极其容易受到损伤。人体在各种应激状态下，如缺氧、严重感染等，可以出现肠道黏膜屏障的改变，通透性增高，免疫功能受到抑制，肠道菌群出现移位，甚至发展为多器官功能障碍综合征（MODS）。呼吸机相关性肺炎也不例外。本实验研究院内制剂急腹症Ⅲ号对呼吸机相关性肺炎肠道黏膜屏障和肠道菌群移位的影响，并探讨其作用机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料

1.1.1 实验动物 100只体重280～320 g的清洁型雄性SD大鼠（上海西普尔必凯实验动物有限公司生产，生产批号：SCXK（沪）2013-0016。实验动物使用许可证号：浙江中医药大学动物实验研究中心，SYXK（浙）2013-0184）。

1.1.2 实验设备 光学显微镜Olympus（日本），石蜡切片机RM2135型（德国），低温高速离心机Beckman（德国），SX-300S凝胶图像分析处理系统（上海小源科技有限公司），高效液相色谱仪（美国water公司），精密电子天平（Sartorius公司），电泳仪（Bio-RAD公司），代谢笼等。

1.1.3 实验药品及试剂 （1）急腹症Ⅲ号（其基本成分为生大黄、川朴、枳壳、丹参、川芎、生山栀、蒲公英），由杭州市中医院制剂室提供（批准文号：浙药制字Z20100112），150 mg/（kg·次）。（2）谷氨酰胺（日本寿制药株式会社）：等氮量的谷氨酰胺0.3 g/kg每日灌胃。（3）乳果糖标准品（上海源叶生物科技有限公司）和甘露醇标准品（国药集团化学试剂有限公司）。

1.2 造模方法

1.2.1 大鼠呼吸机相关性肺炎模型建立[2] （1）经口气管插管：用16和18号静脉套管针制备气管导管。大鼠麻醉前禁食12 h。用质量分数20%的乌拉坦腹腔注射麻醉，用消毒小纱布将舌向左外侧上方轻轻拉出，头部尽量向上抬起，同时上下颌分开。在额戴式喉镜反射光照射下对准声门旋转插入自制气管导管，插入深度为套管针尾部与牙齿平齐。观察棉絮在气管导管口的起伏并用听诊器听双肺呼吸音以确定导管在气管内，将气管导管外层与大鼠上唇缝合固定，连接动物呼吸机控制呼吸。呼吸机参数设定为：潮气量（V）12 mL/kg，呼吸频率70次/min，吸入氧浓度 （FiO2）1.0。为防止体位引起的肺不张，每隔30 min行2～3次大V通气。股静脉插管，以3～5 mL/h输入质量分数为5%的葡萄糖盐水。（2）大鼠VAP模型制备：每只大鼠机械通气24 h（无需使用肌松剂）后，竖起固定板>45°，以微量注射器快速注入0.2 mL 3×108 cfu/L铜绿假单胞菌（PA）菌液和0.55 mL气体，并保持体位5 min。

1.2.2 造模成功的标准[2] （1）出现肺炎临床表现。（2）肉眼观察大鼠肺叶，可见不同程度的融合性出血性病灶。（3）大鼠肺组织光镜下观察呈小叶性肺炎特征。（4）外周血和肺泡灌洗液（BALF）细菌学培养阳性。

1.3 给药方法

将雄性SD大鼠随机分为5组。（1）急腹症Ⅲ号组：大鼠VAP模型，每日灌胃急腹症Ⅲ号2 mL×5 d。（2）谷氨酰胺组：大鼠VAP模型，每日灌胃谷氨酰胺颗粒2 mL×5 d。（3）急腹症Ⅲ号联合谷氨酰胺组：大鼠VAP模型，每日灌胃急腹症Ⅲ号及谷氨酰胺颗粒各2 mL×5 d。（4）安慰剂组：大鼠VAP模型，每日灌胃生理盐水2 mL×5 d。（5）空白对照组：无特殊处理，每日灌胃生理盐水2 mL×5 d。

1.4 检测项目及方法

1.4.1 肠道通透性 术后第5 d，经口灌胃乳果糖+甘露醇混合液2 mL，转代谢笼收集24 h尿液。取10 mL尿液加硫柳汞2 mL 置-20℃冰箱保存。用HS色谱工作站对色谱图形进行积分处理。根据标准曲线计算公式算出标本中甘露醇及乳果糖浓度，从而计算得出L/M。

1.4.2 肠系膜淋巴结培养 术后第6天处死大鼠，在无菌条件下取数枚肠系膜根部淋巴结，经碾磨后置37℃培养箱孵育48 h后鉴定菌种及统计菌落计数。菌落数超过100/g组织为细菌移位阳性。

1.5 统计学方法

使用SPSS 17.0软件对数据进行统计分析。计量资料用均数±标准差（x±s）表示。肠道细菌移位分析（计数资料）采用χ2检验进行组间比较，通透性检测用单因素方差分析及Dunnetts法进行两两比较，组间数据比较采取方差分析，治疗前后比较采取自身对照t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠L/M比较的单因素方差分析

单因素方差分析结果表示，五组术后第5天24 h尿液L/M不全相同（F=19.43，P<0.01）（表1）。进一步采用Dunnetts法进行两两比较，结果显示，安慰剂组L/M高于空白对照组（P<0.05），其余三组则与空白对照组相似，均低于安慰剂组（P<0.01）（表1）。

2.2各组阳性率与安慰剂组的比较

组织培养：细菌培养阳性率见表2，采用χ2检验进行组间比较，安慰剂组明显高于空白对照组（P<0.01），其余三組阳性率均低于安慰剂组（P<0.05）。培养结果主要为大肠杆菌为主的肠道寄生菌。

3 讨论

随着现代医学的发展，人们逐渐认识到胃肠道参与了许多危重病病理生理过程，是严重创伤、休克等等“二次打击”的发生的诱因和参与者。肠道通透性与危重症病情呈正相关，病情越重，肠道通透性越高，而通透性增高又加重病情[3]。肠道通透性增加后，内毒素及细菌就可通过受损的肠黏膜屏障而导致细菌移位。Berg RD和Garlinton AW[4]定义细菌移位：胃肠道内寄生菌通过某些通道进入正常无菌组织，如肠系膜淋巴结和其他脏器，事实上移位应包括所有有活力和无活力的微生物及其产物如内毒素等。促使细菌移位的机制[5]：（1）肠黏膜屏障的损伤和萎缩；（2）机体免疫功能的下降；（3）肠道菌群失调引起细菌过度增殖。研究表明，肠道通透性改变可准确反映肠黏膜的损害。肠道通透性与肠屏障有关，而肠屏障又可从肠黏膜形态的变化来判断其损害的情况。故肠道通透性增高可反映早期肠屏障的损伤。呼吸机相关性肺炎也是如此，本实验通过监测实验大鼠尿液中L/M、肠系膜淋巴结培养来判断其肠黏膜损伤的情况。endprint

急腹症Ⅲ号是我院院内制剂，其基本成分为生大黄、川朴、枳壳、丹参、川芎、生山栀、蒲公英等。主要是根据《伤寒论》大承气汤加减化裁而成，具有泄热通腑，清热解毒等功效，临床上多应用于热瘀所致的腑实证。中医认为“六腑以通为用”，六腑传化水谷，需不断收纳、消化、传导和排泄，虚实更替，宜通而不宜滞，因此通腑法在腑气不通及胃肠功能受损方面屡有见效。大黄作为通腑要药在《神农本草经》中早有记载：“荡涤肠胃，推陈致新，通利水谷，调中化食，安和五脏”。药理研究表明本院内制剂具有抗凝和抑制血小板黏附、聚集、释放及扩张血管的作用，保护肠黏膜屏障功能，减少细菌移位，改善肠黏膜微循环的作用[6]。李军等[7]实验证实急腹症Ⅲ号治疗急性胰腺炎后小肠组织学损害减轻，细菌肠外器官移居程度下降，此结果与陈德昌等[8]的研究结果相符。其治疗重症胰腺炎和降低死亡率机制部分是通过保护肠黏膜屏障功能和减轻小肠缺血性损伤来实现的。

肠黏膜屏障及免疫系统受损，随之发生细菌和内毒素易位，可导致全身炎症反应（SIRS）和多器官功能衰竭（MODS）的发生[9，10]。肠黏膜通透性增高是肠屏障功能受损的重要表现[11]，肠道黏膜通透性增高常常出现在肠黏膜形态学之前。因此，通过测定尿L/M比值可有效地反映肠道通透性的改变[12]。谷氨酰胺对危重患者的肠道保护作用已初步得到肯定[13]，它可以减轻肠屏障损害，防止肠源性感染[14，15]，抑制小肠黏膜萎缩[16]，本实验通过院内制剂急腹症Ⅲ号与谷氨酰胺及空白对照组对比研究发现呼吸机相关性肺炎模型肠道通透性增高（安慰剂组L/M高于空白对照组（P<0.05），细菌移位率增加（安慰剂组明显高于空白对照组（P<0.01）。此结果与Diebel LN等[17]研究结果相似。

综上，院内制剂急腹症Ⅲ号及谷氨酰胺均能减轻呼吸机相关性肺炎肠黏膜结构的破坏，降低肠道通透性及减少肠道菌群移位。关于大黄制剂的作用机制，主要有促进肠道蠕动、改善胃肠黏膜血流[18]、维护肠黏膜黏液屏障、阻止肠道菌群移位、防止肠道内毒素入侵[19]、保持肠道菌群平衡，具有抗炎作用[20]，急腹症Ⅲ号为复方制剂，具体作用成分及机制有待进一步研究探讨。

[参考文献]

[1] Liboni KC，NanLi，Scumpia po，et al.Glutamine modulate LPS induced IL-8 production through IkB/NF-Kb in human fetal and adult hatestinal epithelimn[J].Nutr，2005， 135（2）：245-251.

[2] 武庆平，姚尚龙，袁世萤.呼吸机相关性肺炎动物模型的建立[J].中国危重病急救医学，2005，17（8）：501-502.

[3] Le Voyer T，Cioffi WG，Pratt L，et al.Alterations in imestinal permeability after thermal injury[J].Arch Surg，1992， 127：26-30.

[4] Berg RD，Garlinton AW.Translocation of certain endogenous bacteria from the gastrointestinal tract to the mesenteric lymph nodes and other organs in a gntobiotic mouse modle[J].Infect Lmmun，1979，23：403.

[5] Berg RD.Bacterial translocation from the gastrointestinal tract[J].Adv Exp Med Biol，1999，473：11.

[6] 陈德昌，杨兴易，李红江，等.大黄对危重病患者胃肠道并发症的治疗研究[J].中华急诊医学杂志，2001，10（3）：164-167.

[7] 李军，陈海平，赵金锋.等.中药合剂AA-3对SAP大鼠胰腺结构和功能保护作用的研究[J].中国中医药科技，2008，15（6）：410-412.

[8] 陈德昌，景炳文，杨兴易，等.大黄对危重症患者胃肠道的保护作用[J].中国危重病急救医学，2000，12（2）：87-90.

[9] 黎介寿.加强对肠屏障功能障碍的研究[J].中华医学杂志，1999，79（8）：581.

[10] Van der Hulst RR，Von Meyenfeldt MF，Van Kreel BK，et al.Gut per-meability intestinal morphology and nutritional deplerion [J].Nurition，1998，14（1）：1.

[11] Bjamason I，Macpherson A，Hollander D.Intestinal permeability：An overview[J]. Gastroenterology，1995，108（5）：1566-1581.

[12] 郑治钢.尿L/M比值在估测肠黏膜屏障功能中的价值[J].中国中西医结合外科杂志，2000，6（6）：435-436.

[13] Moise Coeffier，Pierre Dechelotte.The role of glutamine in intensive care unit patients：Mectmnisms of action and clinical outcome[J].Nutrition RevJews，2005，63（2）：65-69.

[14] 蒋小华，李宁，朱维明.肠内免疫营养对手术创伤后机体免疫炎症反应及预后的影响[J].中国实用外科杂志，2004，24（1）：43.

[15] Smith RJ.Gluttamine memholism and its physiologic importance[J].Par-enter Enteral Nur，1999，14（4）：40.

[16] Li Y，Li J，Jiang J，et al.Glycy-glutmine-supplemented long-term total small-bowel auto transplantation in the pig[J].Transpl Int，2003，16（12）：866.

[17] Diebel LN，Dulchavsky SA，Brown WJ.Splanehnic ischemia and bacterial translocation in the abdominal compartment syndrome[J].J Trauma，1997，43：852-855.

[18] 陳德昌，景炳文，杨兴易，等.大黄对胃肠功能衰竭的治疗作用[J].解放军医学杂志，1996，21（1）：2426.

[19] 陈德昌，李红江.大黄在危重病急救领域的药理作用机制[J].中国危重症急救医学，2000，12（7）：439-440.

[20] 阎兆平，陈晓理，张正.大黄与肠道屏障[J].中国中西医结合外科杂志，2001，12（7）：411-413.

（收稿日期：2017-09-18）endprint