兔出血症病毒感染机体后炎性因子的检测分析

仇汝龙++范志宇++王芳++胡波++宋艳华++魏后军++刘星++徐为中+薛家宾

摘要：兔出血症病毒（RHDV）感染成年兔可以诱导兔体内产生强烈的炎性反应，是病毒感染后急性死亡的重要原因之一。为揭示病毒感染机体后体内重要炎性因子的表达情况，采用荧光定量PCR方法检测RHDV感染后6、12、24、30、36 h兔外周血、肝脏和脾脏内病毒增殖情况以及IL-6、IL-10、TNF-α和IFN-γ炎性因子的表达情况。结果表明，兔出血症病毒拷贝数在外周血、肝脏和脾脏内随着感染时间的变化呈快速上升的趋势。外周血、肝脏和脾脏在病毒感染中，促炎性因子IL-6和TNF-α表达水平都明显上调。肝脏促炎性因子IL-6在30 h左右达到最大值，而在外周血和脾脏中则持续上调。抑炎因子IL-10随着炎性因子的上调也随之上升，但其表达水平只有较低程度的上调。IFN-γ相对表达水平在肝脏和脾脏有短暂的上调，在外周血中则持续下调。

关键词：兔出血症病毒；炎性因子；荧光定量PCR；外周血；脾脏；肝脏

中图分类号： S852.65；S858.291文献标志码： A文章编号：1002-1302（2016）02-0238-03

收稿日期：2016-01-20

基金项目：现代农业产业技术体系建设兔体系病毒病预防与控制岗位专项（编号：CARS-44-C-1）；公益性行业（农业）科研专项（编号：201303046）；江苏省自然科学基金（编号：BK20140740）。

作者简介：仇汝龙（1988—），男，山东济宁人，硕士研究生，助理研究员，主要从事家兔疾病防治与兽医生物技术研究。E-mail：qrl8891@163.com。

通信作者：王芳，博士，研究员，主要从事家兔重要疫病致病机制及防控技术的研究。E-mail：rwangfang@126.com。

兔出血症（RHD）是对野兔和家兔具有高度传染性的疾病，其病原是兔出血症病毒（RHDV），属于杯状病毒家族的兔病毒属[1]。感染兔出血症病毒的成年兔在48～72 h内死亡[2]，死亡原因主要为肝脏快速衰竭并伴随强烈的炎症反应。在免疫反应中，调节炎症反应的正是信号通路及细胞因子。

细胞因子是调节性蛋白，在调节免疫反应中的细胞反应阶段有着重要的作用，包括淋巴细胞的激活、增殖、分化、存活和凋亡[3]。它们是低分子量蛋白，主要是由淋巴细胞、抗原呈递细胞、单核细胞、内皮细胞和纤维细胞等分泌。细胞因子可分为不同的类别，比如白介素、干扰素、肿瘤坏死因子和趋化因子等。细胞因子相互作用，施展极化效应于T细胞并且调整免疫反应[4]。CD4+亚群（Th细胞）根据自身所分泌的细胞因子，分为Th1和Th2亚群。Th1细胞分泌IFN-γ、淋巴毒素和IL-2，可以刺激炎症反应，比如迟发型超敏反应，促进补体的产生和细胞毒性T细胞分化。Th2细胞分泌IL-4、IL-5和IL-10等，调节体液免疫反应[5-6]。多数研究证明宿主感染的程度以Th1和Th2细胞为基础[7]。IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IFN-γ和TNF-α等[8-11]兔细胞因子序列的发表，促使检测兔细胞因子的分子生物学试验的产生。荧光定量PCR具有敏感性和结果快速性，可以作为检测细胞因子的方法。本研究通过荧光定量的方法，检测感染RHDV兔体内病毒拷贝数和炎性因子的变化，为研究兔出血症病毒的感染及致病机制奠定基础。

1材料与方法

1.1病毒和试验兔

兔出血症病毒（由江苏省农业科学院兽医研究所保存）；新西兰成年白兔40只，购自南京金陵种兔场。

1.2主要试剂和仪器

Trizol RNAiso plus，反转录试剂盒PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）和荧光定量试剂SYBR Premix EX Taq，均购自Takara公司。pMD18-T Vector和大肠杆菌DH5α均购自南京基天生物公司，荧光定量机器Stepone 7300，人外周血淋巴细胞分离液，购自天津市灏洋生物制品有限责任公司。

1.3引物

炎性因子IL-6、IL-10、IFN-γ和TNF-α的检测引物[12]见表1，VP60模板引物及VP60检测引物建立标准曲线和检测样品[13]。引物由Invitrogen公司合成。

1.4试验动物分组和取样

将40只新西兰兔分为5组，每组5只攻毒兔和3只对照兔，兔攻毒采用颈部皮下注射0.5 mL HA为28 RHDV的肝悬液。5组兔分别在攻毒后6、12、24、30、36 h取样后杀死。血液通过心脏采血，采集后立即分离淋巴细胞和血清，肝脏和脾脏则保存于-70 ℃备用。

1.5RNA的提取及反转录

1.5.1炎性因子RNA提取外周血淋巴细胞、肝脏和脾脏的RNA提取采用Trizol法。按照6、12、24、30、36 h取样，取外周血3 mL采用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞后提取RNA。肝脏和脾脏则称取0.5g匀浆提取RNA。提取的RNA进行反转录。

1.5.2病毒RNA提取病毒拷贝数的定量，采用外周血血清提取RNA，组织则采用0.5 g肝脏和脾脏的匀浆上清液来提取RNA[14]。提取的RNA进行反转录。

1.6荧光定量PCR检测和计算

1.6.1炎性因子的检测炎性因子检测的荧光定量体系：SYBR Mix 10 μL，PCR上下游引物（10 μmol/L）各0.4 μL，ROX 0.4 μL，DNA 模板2 μL，ddH2O 6.8 μL。程序：95 ℃预变性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，循环40次；熔解曲线默认设置。分析数据：细胞因子数据分析采用2-ΔΔCT方法，计算相对表达水平。

1.6.2病毒拷贝数的检测病毒拷贝数的检测需要进行绝对定量，定量体系和程序见“1.6.1”节。结果根据标准曲线计算。

2结果与分析

2.1外周血淋巴细胞的炎性因子和外周血病毒拷贝数

感染RHDV的兔外周血中的病毒拷贝数迅速上升，导致病毒随血液在兔体内传播（图1-A）。炎性因子IL-6和TNF-α表达水平则持续上升直到36 h（图1-B和图1-C），说明炎症反应加剧，而抗炎因子IL-10作为最重要的保护性因子，在外周血淋巴细胞中并没有检测出其mRNA的表达。IFN-γ在感染病毒的外周血中持续下调（图1-D）。

2.2肝脏炎性因子和病毒拷贝数

肝脏作为RHDV感染中急性衰竭的部位，病毒拷贝数快速上升直到36 h（图2-A），炎性因子IL-6和TNF-α也快速上升，表明炎症反应加剧，IL-6相对表达水平在30 h达到最大值，之后则相对表达水平大大降低（图2-B和图2-C）。不同于外周血，抗炎因子IL-10在肝脏中相对表达水平持续处于上调的趋势（图2-D）。IFN-γ在肝脏30 h则有短暂的上调（图2-E）。

2.3脾脏细胞因子和病毒拷贝数

兔体感染RHDV后，脾脏内病毒的拷贝数也持续上升并在30 h达到较高水平（图3-A）。炎性因子IL-6和TNF-α同肝脏一样，处于较高水平的表达（图3-B和图3-C），不同的是脾脏IL-6持续升高直到36 h。抗炎因子IL-10表达水平也有上调，在30 h达到最大值（图3-D）。脾脏的IFN-γ相对表达水平与肝脏相似在30 h都有短暂的上调，然后迅速下调（图3-E）。

3讨论

近年来的研究表明，炎性因子（IL-1β、IL-6、TNF-α等）的急性升高在“暴发性肝脏衰竭” 中有着重要作用，是RHDV感染引起重症炎症反应的关键因素。对炎性因子的研究，可以阐述细胞免疫在RHDV感染病毒清除和肝损伤中的作用，深化免疫损伤理论认识，为发展特异性免疫治疗手段提供了科学依据。炎性因子作为调节性因子存在于整个免疫反应阶段，通过荧光定量PCR对炎性因子的跟踪检测可以对RHDV感染引发的炎症反应进行深入的研究和了解。

本研究发现，通过实时荧光定量PCR的方法，对感染RHDV的兔体内病毒拷贝数和炎性因子进行检测，结合感染后不同时间点的相关结果分析，可以对RHDV感染兔体后的体内传播和引发的炎症反应有较为深刻的了解。

兔出血症病毒在感染成年兔后，体内病毒随血液到达全身，并且快速增殖直到36 h，作为靶器官的肝脏和脾脏内病毒积累量快速上升。病毒量在靶器官增多的同时，炎性因子IL-6和TNF-α的相对表达水平在外周血、肝脏和脾脏中都大幅度上调，暗示炎症反应的加剧。随着炎症反应的加剧，保护性抗炎因子IL-10相对表达水平也有一定程度的上调，以调节炎症反应。但是炎症反应一直处于加剧的趋势，说明炎症反应没有得到有效的控制。肝脏和脾脏中具有抗病毒能力的IFN-γ虽然有一定程度的上调，并不能阻止病毒在两者中的增殖。感染兔出血症病毒的兔体内暴发炎症反应，导致免疫反应的失衡，抗炎因子无法起到保护作用，从而导致肝脏等组织器官衰竭和死亡[15]。总之，感染RHDV的兔体内炎症反应的不断加剧，病毒的快速增殖和在靶器官的不断积累可能最终是导致兔快速死亡的重要原因。本研究为兔出血症病毒感染和致病机制的研究奠定了基础。

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