乙肝病毒检测在临床应用的研究进展

陈善昌

摘要：固相放射免疫法、反向被动血凝改良一步法、酶联免疫吸附法、胶体金免疫层析、实验微粒子酶免疫分析、化学发光免疫法、时间分辨荧光免疫法、核酸探针法、多聚酶链式反应、基因芯片技术方法对检测乙型肝炎有一定的优越性，可为临床诊断、用药疗效等提供准确可靠的实验依据。笔者对相关研究进展进行综述。

关键词：乙型肝炎病毒；酶联免疫吸附法；核酸探针法

中图分类号：R446.112；R512.62 文献标志码：A 文章编号：1008—2409（2016）04—0166—05

1965年Blumberg发现“澳大利亚抗原”，随后确定为乙肝病毒表面抗原（HBsAg），1970年英国的Dane等在电镜下鉴定了直径为42 nln完整的乙肝病毒颗粒，又称为Dane颗粒，1986年被列入嗜肝DNA病毒科，并阐明了颗粒的HBsAg、HBcAg、HBeAg等成分。乙肝病毒检测技术经历了20世纪60年代的放射免疫技术（RIA）、20世纪70年代的酶标技术（ELESA）、20世纪80年代化学发光技术（CLIA）、20世纪90年代的时间分辨技术（TRFIA）及现在正在研究的生物芯片技术。近几年来，随着对乙型肝炎发病机制、HBV感染与复制等研究的深入，发现HBV感染呈世界性分布，许多慢性感染者演变成慢性活动性肝炎、肝硬化、肝癌，严重威胁人类健康。现就乙肝病毒结构、检测及其在临床上的应用综述如下。

1乙肝病毒结构

乙肝病毒结构是一个具有外壳和核心两部分完整的乙肝病毒颗粒，直径约42nm，HBV基因组有一个约3 200 bp小环行DNA结构，双链长度不对称。外壳厚7～8 nm，由脂质双层和蛋白质组成的囊膜。核心部分——含DNA和DNA聚合酶（病毒复制所需的酶），DNA分子含有约3 200个核苷酸。它包括1个长度固定的负链和另一长度不定的正链。正链开放读码区，不能编码病毒蛋白。而负链能编码全部已知的乙肝病毒蛋白质，有4个开放区，分别称为S、C、P及X，这四个开放区的开放读码框架为：①S基因区，由S基因和前S基因组成。S基因（核苷酸155～833）能编码主要表面蛋白。前S基因能编码Pre S1和Pre S2蛋白。②C基因区，由前C基因和C基因组成。分别编码HBeAg及HBcAg。③P基因区，最长，约占基因组75%以上，编码病毒体DNA多聚酶。并具有逆转录酶活性。④X基因区，可能编码有154个氨基酸的碱性多肽，长链的裂口位于此区编码HBxAg，并具有激活HBcAg基因的作用。

2乙肝病毒检测方法

2.1固相放射免疫法（SPRIA）

该法是检测乙肝表面抗原的经典方法之一。是利用放射性同位素标记已知抗原或抗体，使其与待测相应抗体或抗原结合，洗去未结合部分，最好用γ计数器测定放射性强度，从而推算抗原或抗体含量。优点：准确性和灵敏度都较高，检测生物活性物质可达pg水平，比ELISA灵敏度高20倍。缺点：所需设备复杂，操作技术要求较高，乡镇医疗单位难以推广。

2.2反向被动血凝改良一步法

反向被动血凝法（RPHA）检测乙型肝炎表面抗原（HBsAg）具有灵敏、快速、简便、可对表面抗原作相对定量等优点。改良一步法避免了非特异性凝集反应，操作过程及反应时间比反向被动血凝法快1倍以上。节省人力和试剂，适合于常规检查和大规模体检的确证试验。在20世纪70年代至80年代，该方法检测HBsAg在我国占据了重要地位。

2.3酶联免疫吸附法（ELISA）

我国在20世纪70年代开始引入该法检测乙型肝炎标志物，其发展迅速，很快覆盖了医学检验的诸多领域。优点：灵敏度高、特异性强、重复好、简便、经济，对环境和人体无危害，试剂有效期长，是检测乙型肝炎病毒血清标志物首选方法。缺点：抗原抗体比例不合适可引起钩状效应；试剂不均一性、血清不稀释产生的非特异性反应及检验人员熟练程度均可影响其准确性，影响检测结果因素较多。

2.4胶体金免疫层析实验（GICA）

该法是以胶体金作为标志物，利用层析作用检测抗原或抗体。与ELISA比优点：可测末梢全血或血清，用量少、简便、快速、不需仪器设备，尤其为无偿献血者现场采血前的检测，提供了便利条件。缺点：灵敏度较低于ELISA，弱阳性标本容易漏检。有学者采集40份标准血清分别使用以下3种方法进行检测，电化学发光法检出的阳性率为65%，灵敏度100%；进口试剂盒ELISA法的阳性率为65%，灵敏度100%；国产试剂盒ELISA法的阳性率为50%，灵敏度76.9%；胶体金免疫层析法的阳性率为22.5%，灵敏度仅为34.6%。

2.5微粒子酶免疫分析（MEIA）

此法检测表面抗原是目前世界上检测乙型肝炎病毒标记物的金标准。对HBsAg检测灵敏度可达0.17～0.20 ng/ml，优点是：全自动检测，人为造成误差因素少，抗干扰能力强，重复性好，可单份检测，对病情可做动态检测。缺点：仪器和试剂成本较高，基层医院难于普及。

2.6化学发光免疫法（ECLIA）

随着电化学发光免疫分析技术的发展，化学发光应用到临床免疫学检验，该方法学使用固相载体为顺磁性微粒，扩大了反应面积，同时由于标志物的循环利用，延长发光时间，增加强度，大大提高了检测灵敏度，能检出低浓度至0.13 ng/ml的HBsAg，对于控制传染源、流行病学及监测HBV复制状态和评价抗病毒治疗效果有重要作用。

2.7时间分辨荧光免疫法（TRFIA）

该法是我国近年来较多临床实验室检测乙肝两对半最有潜力的一种标记免疫分析方法。其荧光寿命延长了，降低了本底因素影响，特异性和稳定性都有显著提高，现已广泛应用于各种指标的检测。优点：无放射物质危害，不受自然荧光干扰，避免了人为因素引起的加样误差和钩状效应产生，灵敏度和特异性强、标准曲线范围宽、无放射性污染、检测重复性好，能动态观察疗效和监测病情及HBsAb的定量测定能够对乙肝的预防起到监督作用。缺点：检测所需时间过长，无法快速检测，且费用较高，不利于基层以下医院开展。TRFLA法与ELISA法比较：TRFLA法能检测低浓度HBsAg携带者，能在急性乙肝早期检出HBsAg，而ELISA法实验时间虽然较短，但如果标本中HBsAg浓度过高会因钩状效应导致漏检。

2.8核酸探针法

核酸探针技术是属于生物学技术领域的一个先进检测手段，我国20世纪80年代末90年代初发展起来的分子微生物学技术。特点：敏感性和特异性较强。大量研究显示，核酸探针法检出HBV-DNA的阳性率显著高于ELISA法检出的HB eA g的阳性率。

2.9多聚酶链式反应

多聚酶链式反应此法由Saiki首次提出，我国在20世纪90年代初广泛应用，是一种模拟天然DNA复制过程，在体外扩增特异性DNA（或RNA）片段的新技术。可分为定性和定量，其敏感性及特异性比核酸探针法更强。钱宇等研究报道，免疫蒙光定量PCR方法直接测定病毒量，明确反映病毒感染程度，其测定值与ALT呈一定程度正相关，与肝炎轻、中、重程度及肝纤维化程度成反比。

2.10基因芯片技术

又称DNA芯片、生物芯片，是目前研究领域的新检测技术。具有高通量、快速等特点，在病毒基因表达谱的研究、病毒流行学的研究等方面得到广泛的应用。

3乙肝病毒检测在临床的应用价值

乙型肝炎严重危害人类健康，我国是乙型肝炎的高发区，据卫生部统计，目前，乙型肝炎病毒（hepatitis vi-rus B，HBV）携带者在我国已有1.3亿人，约占总人口的1/10。约25%的感染者发展成为慢性乙型肝炎（简称乙肝）。其中慢性乙型肝炎是发展成肝硬化和肝细胞癌的主要危险因素，严重危害我国人民的健康水平和生活质量。乙型肝炎血清学标志物为检测乙型病毒感染的最主要病原标志和直接证据之一。乙肝两对半检查项目包括：乙肝表面抗原（HBsAg）、乙肝表面抗体（HBsAb）、乙肝e抗原（HBeAg）、乙肝e抗体（HBeAb）及乙肝核心抗体（HBcAb）。在病毒感染缓解和愈合的不同时期，可有不同的模式存在。

3.1乙肝两对半各种模式的临床意义

乙肝两对半各种模式的临床意义见表1。

3.2乙肝两对半各项的临床意义

3.2.1乙肝表面抗原 乙肝表面抗原是乙肝病毒的外壳蛋白，本身不具有传染性，但它的出现常伴随乙肝病毒的存在，所以它是已感染乙肝病毒的标志。临床意义：是乙型肝炎病毒感染的早期诊断指标，阳性为已经感染病毒的标志，并不反映病毒复制和传染性的强弱，阴性也不能排除乙型肝炎病毒感染。

3.2.2乙肝表面抗体 当人体受到乙型肝炎病毒侵入后，刺激人的免疫系统产生免疫反应，人体免疫系统中的B淋巴细胞分泌出一种特异的免疫球蛋白G。它可以和表面抗原特异地结合，在体内与人体的其他免疫功能共同作用下，可清除病毒，保护人体不再受乙肝病毒感染，故称表面抗体为保护性抗体。临床意义：为中和性抗体标志，是否康复或是否有抵抗力的主要标志。阳性见于既往感染已好转或接种乙肝疫苗，对乙型肝炎病毒感染具有保护作用。

3.2.3乙肝e抗原 乙肝e抗原是乙型肝炎病毒的核心，是核心抗原裂解后的产物。其临床意义为：阳性为病毒复制标志，病毒复制活跃，传染性强，持续阳性3个月以上则有慢性化倾向。HBeAg阳性与乙肝病毒的复制程度呈正相关，HBeAg是HBV高度传染性的指标。黄建炜等研究，HBeAg阳性标志着HBV的高水平复制，但HBeAg阳性者仅占HBV携带者总数的21.7%，与HBVDNA阳性符合率39.5%，低于HBsAg（79.8%）。

3.2.4乙型肝炎e抗体 乙型肝炎e抗体是由e抗原刺激人体免疫系统产生出来的特异性抗体，这种特异性e抗体能够和e抗原结合。临床意义：阳性说明病毒复制减少，或病毒复制停止标志，传染性较弱但，e抗体阳性不是保护性抗体，患者没有抗乙肝病毒的免疫力。

3.2.5乙肝核心抗体 血清中核心抗原刺激身体的免疫系统产生出特性抗体，即核心抗体，通过检测乙肝核心抗体可以了解人体是否有过乙肝病毒的感染。临床意义：乙肝核心抗体是一项病毒感染的标志。阳性为曾感染或感染期出现的标志。且乙肝病毒复制活跃、是传染性强的指标之一。对于辅助两对半检查有一定意义。

4乙肝病毒DNA及基因分型检测在临床上的应用价值

乙肝病毒DNA定量检测在临床应用越来越广，HBV DNA值更能准确、灵敏地反映HBV病毒复制的程度。体内有无HBV复制最好通过乙肝五项指标及HBV DNA的检测结果提示来判断患者的免疫恢复、病情分期或排除HBV感染的存在才能为患者的病情提供较为准确的判断，较好地为临床合理治疗用药提供依据。乙肝病毒DNA定量检测指标降低是乙肝转阴的前奏，也是康复最为关键的一步，只有体内的乙肝病毒DNA定量指标降低，乙肝病毒的复制繁殖才会停止，乙肝的彻底治愈才有希望，因此，荧光定量PCR检测乙肝病毒DNA，为临床医生对乙型肝炎传染性的判断、用药疗效的监测及预后的判断提供了诊断依据。乙肝病毒定量检测，对治疗前进行检测可以指导选择对症药品，避免盲目用药；对治疗后定量PCR检测可直接正确地测定体内乙肝病毒数目，有助于用药疗效的判定及指导用药。王永忠等对146份急慢性肝炎、肝硬化和肝癌患者血清中HBV DNA基因分型研究结果，肝硬化和肝癌患者主要为C基因型感染，显著高于慢性乙型肝炎患者，（X²=7.65，P=0.01）。姚光弼等的研究报道，ALT反跳合并有HBVDNA的反跳患者有38.7%，而HBV DNA反跳时合并有ALT的反跳的患者只有18.5%，HBV DNA的反跳与ALT的反跳似乎没有必然的联系。

综上所述，酶联免疫吸附法（ELISA）灵敏度高、特异性强，成本较低，适合于血站、综合医院等标本量大的医疗机构实验室开展；胶体金免疫层析法适合于快速检测时使用；微粒子酶免疫分析（MEIA）、化学发光免疫法（ECLIA）和时间分辨荧光免疫法（TRFIA）因成本较高，适合于经济条件较好的医疗机构实验室开展。乙型肝炎标志物检测方法各有优越性，检验的目的是为临床服务，因此，各临床实验室应该根据自己条件及临床医生的要求来选择检测方法，为临床诊断、用药疗效等提供准确可靠的实验依据。