P27通过调控Bcl—2对哮喘大鼠气道平滑肌重塑的影响

徐慧　　雷丹　　彭燕平　　戴元荣

[摘要] 目的 观察P27kip-1（以下简称P27）是否通过调控Bcl-2影响哮喘大鼠气道重塑的发生发展。 方法 SPF级雄性大鼠30只随机分成正常对照组和哮喘组，各15只。用卵白蛋白（OVA）致敏和激发的方法制备哮喘模型。观察各组大鼠肺组织病理超微结构变化，分析支气管肺泡灌洗液（BALF）中的细胞分类计数，并采用免疫组化法测定各组大鼠肺组织中P27、Bcl-2表达情况。 结果 哮喘组嗜酸粒细胞计数比例均显著高于对照组（P<0.01），哮喘组肺组织P27表达低于对照组（P<0.01），哮喘组肺组织Bcl-2表达高于对照组（P<0.01）。 结论 P27通过调控Bcl-2抑制气道平滑肌细胞增生进而影响气道重塑。

[关键词] 哮喘；P27；Bcl-2；气道重塑

[中图分类号] R562.25 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2017）34-0028-04

Effect of P27 on airway smooth muscle remodeling in asthmatic rats by regulating Bcl-2

XU Hui LEI Dan PENG Yanping DAI Yuanrong

Department of Respiratory Diseases， Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University， Wenzhou 325027， China

[Abstract] Objective To investigate whether P27kip-1（hereinafter referred to as P27） regulates the development of airway remodeling in asthmatic rats via Bcl-2. Methods 30 SPF male rats were randomly divided into normal control group（n=15） and asthma group（n=15）. Asthma models were prepared by sensitization and challenge with ovalbumin （OVA）. The pathological and ultrastructural changes of lung tissue in each group were observed. The cell differential count in bronchoalveolar lavage fluid（BALF） was analyzed. The expressions of P27 and Bcl-2 in lung tissue of each group were detected by immunohistochemistry. Results The percentage of eosinophil count in asthma group was significantly higher than that in control group（P<0.01）. The expression of P27 in lung tissue of asthma group was lower than that in control group（P<0.01）. The expression of Bcl-2 in lung tissue of asthma group was higher than that in control group（P<0.01）. Conclusion P27 inhibits airway smooth muscle cell proliferation and thus affects airway remodeling through the regulation of Bcl-2.

[Key words] Asthma； P27； Bcl-2； Airway remodeling

支气管哮喘（哮喘）发病的病理基础为气道重塑，目前对于改善或延缓气道重塑缺乏有效对策。近年来，研究发现气道平滑肌细胞（ASMC）重塑和凋亡失衡导致了支气管哮喘的发生发展[1，2]。凋亡是在基因控制下，细胞自主、有序的死亡过程[3]。P27kip-1（以下简称P27）为细胞周期负性调节因子，分子量约27 kD，主要定位于细胞核，通过抑制周期蛋白E-周期蛋白依赖激酶2（cyclinE-CDK2）和周期蛋白D-周期蛋白依赖激酶4（cyclinD-CDK4）等激酶复合物活性，使细胞周期停滞在G1期，从而抑制细胞的增殖[4]。最近研究发现P27除了发挥G1期细胞阻滞以外，还具有调节细胞凋亡的功能。凋亡的调控涉及许多基因，Bcl-2作为抑制凋亡最重要的调控基因，在哮喘的发病机制中占有重要的地位[5，6]。Bcl-2家族蛋白在线粒体凋亡路径中具有重要的调节作用，其中促凋亡蛋白，如Bax、Bid等可通过增强线粒体膜通透性，导致细胞色素C及其他促凋亡蛋白释放[7]。本研究发现P27通过调节Bcl-2调控气道平滑肌细胞的凋亡，现报道如下。

1材料与方法

1.1 实验材料

SPF级SD雄性大鼠30只，体质量160～200 g，由温州医科大学实验动物中心提供，实验动物许可证SYXK（浙）2010～0150。兔抗鼠P27kip-1多克隆抗体（Cell Signal Technology，U.S.A），兔抗鼠Bcl-2多克隆抗體（Cell Signal Technology，U.S.A），辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔二抗（Cell Signal Technology，U.S.A），TUNEL检测试剂盒（北京中杉生物技术有限责任公司），SABC免疫组化二抗试剂盒（上海晶美生物技术有限公司），DAB显色试剂盒（上海晶美生物技术有限公司）。endprint

1.2 实验方法

1.2.1 动物模型的制备 按照随机数字表法将30只SD大鼠随机分为正常对照组（C组，n=15）和哮喘组（A组，n=15），饲养于温州医科大学实验动物中心，参考相关文献[8]略加改进制备哮喘模型，哮喘组分别于第1天和第8天大鼠腹腔注射1 mL OVA/AL（OH）3混合液，内含1 mg OVA和100 mg Al（OH）3致敏，正常对照组用生理盐水代替。第15天开始用含1% OVA的生理盐水进行激发，每日激发哮喘1次，共6周。哮喘组大鼠表现出呼吸急促、喘息、抽搐等症状，可闻及喘鸣音，严重者出现动作迟缓、俯卧不动、反应迟钝等症状，对照组则无此症状，大体行为上提示造模成功，造模成功后继续行组织切片观察大鼠肺组织超微结构变化。

1.2.2 各组大鼠肺组织病理超微结构的变化 各组大鼠分别于末次激发后24 h内，10%水合氯醛溶液（5 mL/kg）腹腔麻醉。切取左肺肺门中上、中下肺段组织，做石蜡包埋切片，分别做HE和免疫组化。切片在HE染色后，于光镜下观察哮喘组和正常对照组的肺组织结构，是否存在上皮损伤，以及观察支气管及血管周围是否存在炎症浸润。

1.2.3 细胞分类计数 BALF液离心，取沉渣用PBS重悬后滴于载玻片上涂片，晾干后用加瑞氏染液固定，再加等量缓冲液与染料混匀后进行染色，约5～10 min，再用自来水缓慢冲去染液。在高倍镜下，选择染色良好的区域，并且按一定顺序，对200个白细胞做细胞分类计数。

1.2.4 凋亡指数的测定 高倍镜下（×400）随机取管腔直径1000 μm左右的支气管，每张切片至少观察500个支气管平滑肌细胞，计算每100个支气管平滑肌细胞中的凋亡细胞数，求得凋亡指数（AI），AI=凋亡细胞数/总细胞数×100%。

1.2.5 免疫组化法检测 ASMCs上caveolin-1、p-AKT的表达 按SABC免疫组织化学染色方法检测肺组织P27、Bcl-2蛋白表达。试剂盒为上海晶美生物技术有限公司生产，按说明书操作步骤进行操作，P27、Bcl-2抗体的稀释度均为1∶100。对照试验选用PBS代替一抗，其他步骤相同。以气道平滑肌层为分析对象，进行测定P27、Bcl-2阳性表达的平均吸光度值。

1.3 统计学方法

应用 SPSS 19.0统计软件对数据进行分析，计量资料予以正态性检验，用均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用t检验，两变量的相关分析采用Pearson等级相关法，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠症状、体征比较

在连续OVA激发后，哮喘组大鼠出现打喷嚏、烦躁不安、呼吸急促、口腔分泌物增多等症状，并且有哮鸣音，部分情况严重的出现腹肌抽搐、反应迟钝、行动迟缓等表现，但无大鼠死亡，对照组则无此种表现。

2.2 两组大鼠肺组织病理结构的变化

两组大鼠的肺组织石蜡切片，进行HE染色后，在光镜下观察到A组大鼠肺组织内支气管上皮断裂、脱落，支气管壁和血管周围可见较多的炎性细胞如嗜酸性粒细胞、淋巴细胞浸润，管腔内可见黏液栓形成，对照组未见上述现象。见封三图2。TUNEL法显示：哮喘组大鼠ASMC中TUNEL阳性细胞明显少于正常对照组，凋亡指数（AI）哮喘组为（3.6±0.2），正常对照组为（6.1±0.3），（t=11.12，P<0.01），见封三图3。

2.3两组大鼠中细胞分类计数的比较

哮喘组大鼠BALF中嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、中性粒细胞、巨噬细胞占细胞总数的百分比均显著高于正常对照组（P<0.01），综合上述结果提示哮喘造模成功，见表1。

2.4 免疫组化结果

免疫组化观察各组大鼠肺组织P27、Bcl-2表达。Bcl-2蛋白均表达于胞浆，阳性细胞胞浆呈棕黄色，主要定位于平滑肌细胞、支气管上皮细胞及散在的炎性细胞，哮喘组Bcl-2表达量明显高于正常对照组（P<0.01），见封三图4。P27蛋白主要定位在细胞核，胞质少量表达，哮喘组P27表达量明显低于正常对照组（P<0.05），见封三图5，表2。

2.5相关性分析

平滑肌细胞中P27表达与细胞凋亡呈正相关（r=0.612，P<0.05）。

3 讨论

近年来随着对支气管哮喘发病机制研究的不断深入，研究者发现气道壁的结构改变即气道重塑（airway remodeling）[9-12]是哮喘除气道慢性炎症以外又一重要病理特征，是哮喘患者出现不可逆或部分不可逆气流受限及持续的气道高反应性的病理学基础。哮喘时气道平滑肌细胞存在增殖增加和凋亡不足[13]，共同参与气道重塑的形成。因此，应该把支气管平滑肌细胞作为哮喘气道重塑研究的标靶。

近年来，随着细胞分子生物学的发展，对调控细胞增殖的中心事件即细胞周期的调控机制有了更为深刻的认识。各种丝裂原通过不同的信号传导途径促进细胞增殖，都是要经过细胞分裂周期来完成的，而各级细胞因子对细胞周期进行了精密的调控。P27基因定位于人类染色体12p13，编码198个氨基酸，具有高保守性。P27蛋白主要定位于细胞核，N段第28-87位氨基酸中有两个丝氨酸磷酸化位点，介导周期蛋白依赖激酶（CDK）活性的抑制。P27作为细胞周期负性调节因子，动物研究发现，几乎所有组织均表达P27蛋白，参与细胞增殖和凋亡调节的P27蛋白极有可能在一些与细胞凋亡紧密相关的疾病中扮演着重要角色。对乳腺癌细胞和其他肿瘤细胞的研究表明P27的過度表达不仅诱导细胞周期阻滞，还促进凋亡发生[14-17]。凋亡通常发生在G1期，G1期的阻滞会加速或促进凋亡。所以G1晚期表达的P27蛋白应该是凋亡调节的节点之一。携有P27的腺病毒载体已经在动物实验中具有很好的促细胞凋亡作用。其对气道平滑肌细胞的凋亡是否也有调节作用？P27是通过什么途径促进细胞凋亡的？endprint

細胞凋亡是受严格控制的细胞死亡过程，与多种疾病密切相关，是当今生命科学研究中最热门的领域之一。在细胞凋亡过程中，Bcl-2家族成员起着至关重要的作用，其中Bcl-2被认为是抑制细胞凋亡最重要的调控基因。Bcl-2 家族对于线粒体膜上的膜通透性孔道的开放和关闭起关键的调节作用。有研究发现，Bcl-2可抑制线粒体膜电位的降低，减少细胞色素C和凋亡诱导因子的释放及Caspase（半胱天冬酶）的激活，从而抑制细胞凋亡[18-19]。在无死亡信号刺激时，Bcl-2作为抗凋亡蛋白被细胞器膜隔离起来，在收到死亡信号刺激时便发生构象变化，从胞液易位到线粒体外膜上，使抗凋亡蛋白丧失对凋亡的抑制[20-21]。通过本实验结果显示哮喘组P27蛋白的表达量低于对照组，相关分析结果表明，P27表达量与细胞凋亡率呈正相关，提示P27分子可能参与调节气道平滑肌凋亡过程，哮喘组P27表达减少，Bcl-2表达增加，导致平滑肌细胞凋亡不足，促进了哮喘气道重塑。本课题组前期研究发现，P27能激活线粒体凋亡通路，促进细胞凋亡，本研究结果显示，其作用机制可能是通过调控Bcl-2实现的。

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（收稿日期：2017-10-25）endprint