川芎嗪调控PKCβ1减轻波动高糖诱导人脐静脉内皮细胞损伤的实验研究

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·基础医学论著/研究·

川芎嗪调控PKCβ1减轻波动高糖诱导人脐静脉内皮细胞损伤的实验研究

王景尚1，黄烨2，殷惠军3，孙明月2，石颖2

目的观察川芎嗪对波动高糖诱导人脐静脉内皮细胞损伤及蛋白激酶Cβ1(PKCβ1)表达的影响。方法分离、鉴定并培养人脐静脉内皮细胞，实验共分为7组：正常低糖(N)组、稳定高糖(W)组、波动高糖(B)组、稳定高糖+LY333531(WL)组、波动高糖+LY333531(BL)组、波动高糖+川芎嗪(TMP)组和波动高糖+二甲双胍(MH)组。8 d后检测各组细胞凋亡率、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、可溶性细胞间黏附分子1(sICAM-1)、晚期氧化蛋白产物(AOPP)和总抗氧化能力(T-AOC)水平及细胞PKCβ1蛋白表达情况。结果与N组相比，W组和B组HUVECs总凋亡率、TNF-α、sICAM-1、AOPP含量、PKCβ1蛋白表达均显著升高(P<0.01)，T-AOC显著降低(P<0.01)，且W组和B组间差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。应用TMP和MH干预具有与LY333531阻断相似的效应，可显著降低细胞的总凋亡率、TNF-α、sICAM-1、AOPP含量及PKCβ1蛋白表达(P<0.01)，同时可显著升高T-AOC水平(P<0.01)。结论波动性高糖状态具有显著加重人脐静脉内皮细胞损伤的效应，且该效应与PKCβ1表达水平显著升高密切相关；川芎嗪对波动性高血糖状态下的血管内皮功能具有明显的保护作用，其作用机制与其显著抑制PKCβ1的过表达进而减轻氧化应激和炎症反应密切相关。

脐静脉内皮细胞损伤；川芎嗪；波动高糖；蛋白激酶Cβ1；肿瘤坏死因子α；可溶性细胞间黏附分子1

2型糖尿病是冠心病的等危症，血管并发症的发生是糖尿病病人出现高致残率、高致死率的主要原因[1]。课题组前期通过纳入冠心病病人并应用寡核苷酸基因芯片技术成功构建了冠心病白细胞差异基因表达谱，同时深入分析发现，其中的差异基因蛋白激酶Cβ1(PKCβ1)位于冠心病疾病网络的关键调控环节[2]。高血糖状态是糖尿病病人的显著特征，与血管损伤在内的糖尿病长期并发症的发生发展密切相关。大量临床和基础研究证实，相对于血糖控制良好的稳定性高血糖病人，血糖控制不良的“波动性高血糖”糖尿病病人更易出现慢性血管并发症，而且血糖波动的幅度越大，其并发症的发生率就越高、预后就越差[3-5]。这已成为目前糖尿病预防和治疗研究领域的热点之一。蛋白激酶C(PKC)途径被认为是糖尿病血管病变的关键机制[6]。基于此，推测冠心病关键调控基因蛋白激酶Cβ1参与波动性高血糖诱导的血管内皮损伤过程。现代药理研究发现，川芎嗪具有较好的抗脂质过氧化和保护血管内皮细胞功能等作用[7-8]，那么，其保护血管内皮功能的作用是否与调控PKCβ1基因有关？其在波动性高血糖血管病变中是否也发挥重要作用呢？基于此，本研究通过体外构建波动性高血糖诱导损伤人脐静脉内皮细胞实验模型，探讨川芎嗪对波动高糖损伤血管内皮的影响及其机制。

1 材料与方法

1.1 实验药物 盐酸川芎嗪(Tetramethylpyrazine hydrochloride，TMP，批号：201121126)、盐酸二甲双胍原料药(metformin hydrochloride，MH，批号：20111125)均购自大连美仑生物技术有限公司；LY333531(PKCβ1抑制剂，批号：02011306)购自美国Sigma-Aldrich公司。

1.2 人脐静脉内皮细胞的分离、培养与鉴定 健康产妇脐带取自北京海淀区妇幼保健医院。人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)的分离方法参照Jaffe等[9]方法。无菌条件下取健康产妇正常分娩的新生儿脐带应用0.1%胶原酶Ⅰ脐静脉灌流消化分离细胞15 min，以1 500 r/min离心10 min，收集内皮细胞。接种于含20%胎牛血清、10 ng/mL EGF、40 U/mL肝素、20 mmol/L谷氨酰胺、50 U/mL青霉素、50 μg/mL链霉素、0.11 mg/mL丙酮酸钠的低糖型DMEM培养基中，再置于含5% CO2的37 ℃培养箱中培养24 h换液，以后每2 d～3 d更换一次，观察细胞生长情况，倒置相差显微镜下观察到内皮细胞形态单一，呈棱形或多角形，细胞边界清楚，胞质丰富，胞核呈椭圆形、靠近中央，核仁明显。检查3 d～5 d细胞融合连成片，铺满培养瓶，呈鹅卵石样排列，以0.25%胰酶-EDTA溶液消化传代培养。所用实验细胞均为第3代～5代细胞。

1.3 实验分组及干预 实验分为7组。正常低糖(N)组：持续低糖型DMEM全培养基培养；稳定性高糖(W)组：持续高糖型DMEM全培养基培养；波动性高糖(B)组：高糖型DMEM全培养基/低糖型DMEM全培养基培养，每24 h更换一次；稳定性高糖+LY333531(WL)组：对稳定性高糖组进行LY333531(200 nmol/L)干预，预处理1 h；波动性高糖+LY333531(BL)组：对波动性高糖组进行LY333531(200 nmol/L)干预，预处理1 h；盐酸川芎嗪(TMP)组：对波动性高糖组运用川芎嗪(500 μmol/L)进行干预和盐酸二甲双胍(MH)组：对波动性高糖组运用盐酸二甲双胍(1 mmol/L)进行干预。各组细胞在37 ℃，5% CO2条件下培养8 d后，收集细胞上清液进行进一步检测。

1.4 指标检测 采用流式细胞术检测各组细胞凋亡水平，定量ELISA法测定细胞上清液肿瘤坏死因子α(TNF-α)、可溶性细胞间黏附分子1(sICAM-1)、晚期氧化蛋白产物(AOPP)和总抗氧化能力(T-AOC)水平，Western blot法检测细胞PKCβ1蛋白表达。

2 结 果

2.1 不同培养条件葡萄糖培养及药物干预对HUVECs凋亡的影响 与N组相比，W组和B组HUVECs总凋亡率均明显增加(P<0.01)，且凋亡以晚期凋亡为主，组间差异有统计学意义(P<0.05)；应用LY333531阻断后，WL组和BL组细胞总凋亡率均显著下降(P<0.05或P<0.01)；应用TMP和MH干预亦可显著降低细胞的总凋亡率(P<0.01)，二者均以抑制早期凋亡为主。详见图1、图2。

注：与N组相比，*P<0.05，**P<0.01；与W组相比，#P<0.05，##P<0.01；与B组相比，▲P<0.01。图1 不同培养条件葡萄糖培养及药物干预对HUVECs凋亡的影响

图2 不同培养条件葡萄糖培养及药物干预对细胞凋亡影响的典型流式图

2.2 不同培养条件葡萄糖培养及药物干预对HUVECs炎症反应的影响 与N组相比，W组和B组HUVECs 炎症因子TNF-α和sICAM-1含量均明显增加(P< 0.01)；与W组相比，B组HUVECs TNF-α和sICAM-1含量又有进一步升高(P<0.05或P<0.01)；应用LY333531阻断后，WL组和BL组细胞TNF-α和sICAM-1水平显著下降(P<0.05或P<0.01)；应用TMP和MH干预后，细胞TNF-α和sICAM-1水平亦显著下降(P<0.01)。详见表1。

组别nTNF-αsICAM-1N组60.11±0.01 1.29±0.79W组60.14±0.021)4.23±1.061)B组60.17±0.021)3)5.85±2.291)2)WL组60.11±0.012)2.50±0.862)BL组60.12±0.024)3.26±1.414)TMP组60.13±0.034)3.44±1.174)MH组60.12±0.024)2.82±1.194) 与N组相比,1)P<0.01;与W组相比,2)P<0.05,3)P<0.01;与B组相比,4)P<0.01。

2.3 不同培养条件葡萄糖培养及药物干预对HUVECs 氧化应激反应的影响 与N组相比，W组和B组HUVECs AOPP含量显著增多(P<0.01)，T-AOC显著降低(P<0.01)，且B组与W组比较差异有统计学意义(P<0.01)；应用LY333531阻断后，WL组和BL组细胞AOPP含量均显著下降(P<0.01)，同时伴T-AOC显著升高(P<0.05或P<0.01)；应用TMP和MH干预后，AOPP含量均显著下降(P<0.01)，且T-AOC显著升高(P<0.01)。详见表2。

组别nAOPP(pmol/L) T-AOC(U/L)N组6210.48±107.622652.08±253.94W组6527.45±202.891)2072.83±202.351)B组6677.05±123.361)2)1643.15±104.811)3)WL组6337.88±135.283)2358.78±209.172)BL组6402.77±102.854)2089.70±150.494)TMP组6368.01±75.714)2322.43±334.454)MH组6358.79±92.584)2089.27±205.224) 与N组相比,1)P<0.01;与W组相比,2)P<0.05,3)P<0.01;与B组相比,4)P<0.01。

2.4 不同培养条件葡萄糖培养及药物干预对HUVECs PKCβ1蛋白表达的影响 与N组相比，W组和B组细胞PKCβ1蛋白表达均显著升高(P<0.05或P<0.01)，且B组与W组比较差异有统计学意义(P<0.05)；应用LY333531阻断后，WL组和BL组PKCβ1蛋白表达水平显著下降(P<0.01)；应用TMP和MH干预后，PKCβ1蛋白表达不同程度下降(P<0.05或P<0.01)，且作用与LY333531相似。详见图3。

注：与N组相比，*P<0.05，**P<0.01；与W组相比，

#P<0.05，##P<0.01；与B组相比，▲P<0.05，▲▲P<0.01。

图3各组细胞PKCβ1蛋白表达水平的比较

3 讨 论

川芎嗪是从伞形科藁本属植物川芎中提取的生物碱—四甲基吡嗪，是川芎的有效成分之一。现代药理学研究表明：川芎嗪具有保护血管内皮、抗动脉粥样硬化、抗炎、抗氧化应激等多种心脑血管药理学作用，广泛应用于闭塞性心脑血管疾病、糖尿病、肿瘤等多种疾病的治疗[7，10]。血管内皮功能损伤是糖尿病血管病变发生发展的前提和基础[11-12]。血糖波动被认为是糖尿病血管病变的重要危险因素之一，与血管并发症的发生密切相关。

本研究应用流式细胞术测定细胞凋亡方法评价血糖波动对内皮细胞损伤的影响，结果表明，高糖状态下内皮细胞凋亡率显著上升，而且在波动高糖状态下表现得更为明显。提示，血糖波动性的增加具有加重内皮细胞损伤的效应。同时，应用LY333531阻断PKCβ1表达以及川芎嗪和二甲双胍干预，发现细胞凋亡率均显著下降。提示，PKCβ1在波动高糖损伤内皮过程中具有重要作用，而药物干预具有显著拮抗波动高糖内皮损伤的作用，且与PKCβ1抑制剂的作用相似。

炎症因子和黏附分子的分泌和释放在糖尿病血管病变中具有重要作用[13]。TNF-α主要由单核/巨噬细胞分泌，是一种具有多种生物学效应的细胞因子。作为前炎症因子，参与包括糖尿病在内的多种疾病的发生和病情演变，并直接参与血管病变的病理过程[14]。ICAM-1(CD54)是细胞间黏附分子的一种，属于免疫球蛋白超家族，在炎症细胞黏附、聚集中发挥重要作用。正常情况下，sICAM-1在内皮细胞处于低表达水平，但在白细胞介素-1(IL-1)、TNF-α和LPS等炎症介质刺激后表达急剧增加，参与白细胞与血管内皮细胞黏附及向血管外迁移、黏附心肌细胞和释放细胞毒的过程。氧化应激是导致糖尿病内皮损伤的重要原因[15-16]。晚期氧化蛋白产物是氧化应激过程中生成的一类含双酪氨酸的蛋白交联物，既能反映机体内氧化应激状态，还可起到炎症递质的作用[17]。总抗氧化能力是机体酶性和非酶性抗氧化物整体水平的具体体现，能反映机体抗氧化酶的活力以及抗氧化系统所处的功能状态[18]。本研究结果显示：高糖刺激能显著促使内皮细胞TNF-α、sICAM-1的合成增多，并显著诱导内皮细胞过氧化产物的生成及抗氧化能力的下降，而波动高糖效应更加明显。应用PKCβ1抑制剂干预可显著逆转血糖波动造成的损伤。应用川芎嗪和二甲双胍干预均具有显著抗炎、抑制细胞黏附、拮抗氧化的效应，且与PKCβ1抑制剂的作用相似。

既往研究表明，PKC在糖尿病病人中处于持续的活化状态，同时参与糖尿病及其并发症的发生与发展[19]。Quagliaro等[20]应用间断性高血糖(5 mmol/L和20 mmol/L)培养基培养人脐静脉内皮细胞2 周后发现PKC活化具有加重波动高糖损伤内皮的作用，而其亚型PKCβ1在该过程中发挥至关重要的作用。本研究中，测定内皮细胞中PKCβ1蛋白表达情况，并运用LY333531对其进行了阻断，发现了相似的结果。应用川芎嗪和二甲双胍干预均可显著抑制PKCβ1蛋白表达。提示川芎嗪拮抗波动高糖内皮损伤效应与其显著抑制内皮细胞PKCβ1过表达有关。

综合本研究可以看出，波动性高血糖加重人脐静脉内皮细胞损伤的作用与其能够诱发PKCβ1过度表达密切相关；川芎嗪对波动性高血糖状态下的血管内皮功能具有显著保护效应，其机制与其抑制PKCβ1的过表达进而减轻氧化应激和炎症反应密切相关。此外，本研究结果也提示川芎嗪在防治糖尿病血管并发症中具有一定的应用前景，但仍有待进一步临床研究验证。

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(本文编辑郭怀印)

Tetramethylpyrazine Ameliorates High Blood Glucose Fluctuations Induced-human Umbilical Vein Endothelial Cell Injury by Regulating PKCβ1Expression

Wang Jingshang，Huang Ye，Yin Huijun，Sun Mingyue，Shi Ying

Beijing Obstetrics and Gynecology Hospital，Capital Medical University，Beijing 100026，China Corresponding Author：Huang Ye (Xiyuan Hospital，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing，China)

ObjectiveTo investigate the effects of Tetramethylpyrazine (TMP) on human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) injury induced by high blood glucose fluctuations and the PKCβ1expression.MethodsHUVECs were incubated for 8 days in media containing different glucose concentrations：5.56 mmol/L (normal glucose，N)，25 mmol/L (constant high glucose，W)，or a daily alternating 5.56 or 25 mmol/L glucose (fluctuant high glucose，B).LY333531 (200 nmol/L) was pretreated on W group (WL) and B group (BL)，respectively.Meanwhile，B group were treated with tetramethylpyrazine hydrochloride (500 μmol/L) and metformin hydrochloride (1 mmol/L)，respectively，which were called as TMP group and MH group.Cell apoptosis was measured by flow cytometry.The concentrations of tumor necrosis factor-alpha (TNF-α)，soluble intercellular adhesion molecule-1 (sICAM-1)，AOPP and total antioxidant capacity (T-AOC) in the cell culture supernatant were measured by ELISA method.The expression of protein kinase C (PKC) β1in HUVECs was measured by Western blot.ResultsIn comparison with N group，cell apoptosis rate (mainly late apoptosis)，levels of TNF-α，sICAM-1 and AOPP，the expression of PKCβ1in W group and B group were all significantly increased (P<0.05 or P<0.01)，whereas T-AOC was significantly decreased (P<0.01)，all especially in B group (P<0.05 or P<0.01).Pretreated with LY333531，cell apoptosis rate，levels of TNF-α，sICAM-1 and AOPP，as well as the expression of PKCβ1，were all significantly decreased (P<0.05 or P<0.01)，meanwhile T-AOC was significantly increased (P<0.05 or P<0.01).TMP and MH manifested the similar protective effects as LY333531.ConclusionHigh blood glucose can induce HUVEC injury obviously，which is closely related to PKCβ1over-expression.Tetramethylpyrazine can protect HUVECs suffering fluctuant high glucose obviously，and the protective mechanism of which is closely related to its effects of relieving vessel stress，alleviating inflammatory reaction and inhibitory effect on the expression of PKCβ1.

human umbilical vein endothelial cells injury；tetramethylpyrazine；high blood glucose fluctuations；protein kinase Cβ1；tumor necrosis factor-alpha；soluble intercellular adhesion molecule-1

国家自然科学基金青年基金资助项目(No.81202777)；国家自然科学基金面上项目(No.81573803)

1.首都医科大学附属北京妇产医院(北京 100026)；2.中国中医科学院西苑医院；3.甘肃中医药大学

黄烨，E-mail：yellow_926@126.com

信息：王景尚，黄烨，殷惠军，等.川芎嗪调控PKCβ1减轻波动高糖诱导人脐静脉内皮细胞损伤的实验研究[J].中西医结合心脑血管病杂志，2017，15(16)：1969-1973.

R587 R285.5

：Adoi：10.3969/j.issn.1672-1349.2017.16.006

：1672-1349(2017)16-1969-05

2017-01-26)