氨甲酰化促红细胞生成素对慢性心力衰竭大鼠心肌细胞凋亡及cleaved Caspase-3蛋白表达的影响

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氨甲酰化促红细胞生成素对慢性心力衰竭大鼠心肌细胞凋亡及cleaved Caspase-3蛋白表达的影响

黄兆琦1，伍金雷1，许卫1，陈永权1，谢文杰1，陈晞明1，陈盛强2

目的观察氨甲酰化促红细胞生成素(CEPO)对慢性心力衰竭(CHF)大鼠心功能、心肌细胞凋亡及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)蛋白活化表达的影响。方法将30只雄性成年SD大鼠随机分为假手术(Sham)组(n=10)、CEPO组(n=10)和对照(Control)组(n=10)，采用腹主动脉缩窄术制作慢性心力衰竭模型，术后第8周CEPO组开始经腹腔注射50 μg/kg CEPO，3次/周，连续4周；Sham组、Control组同期经腹腔注射等量0.9%氯化钠溶液。术后第8周、12周行心脏彩超检测大鼠心功能。术后第12周末取大鼠心肌组织切片采用HE染色法观察心肌组织细胞形态；采用原味缺口末端标记(TUNEL)法检测心肌细胞凋亡及计算凋亡指数(AI)；采用Western blot印迹法检测心肌活化型Caspase-3(cleaved Caspase-3)蛋白表达水平。结果与假手术组相比，建模大鼠术后第8周时出现心室肥厚及左室射血分数(LVEF)减退；CEPO组干预4周后左室射血分数较Control组明显升高(P<0.05)，收缩末期室间隔厚度(IVSs)、收缩末期左心室后壁厚度(LVPWs)、舒张末期室间隔厚度(IVSd)、舒张末期左心室后壁厚度(LVPWd)明显降低(P<0.05)。与Control组比较，CEPO组AI值显著降低[(23.87±1.45)% vs(30.15±0.67)%，P<0.05]，cleaved Caspase-3表达水平(0.489 1±0.029 1)明显减少(P<0.01)。结论CEPO可通过抑制凋亡关键酶Caspase-3的活化，显著减少cleaved Caspase-3蛋白的表达水平，减少心肌细胞凋亡以改善心功能。

心力衰竭；氨甲酰化促红细胞生成素；心肌凋亡；活化型Caspase-3蛋白

慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)是一种复杂的临床症候群，发病率和病死率高，5年生存率与恶性肿瘤相仿，严重威胁着病人的生命[1]。终末期充血性心力衰竭病人心脏中长期的压力负荷过重致使心肌细胞数目的减少及心肌组织纤维增生，是引起心肌舒缩功能障碍的主要原因之一。而有实验证明心肌细胞的减少主要是因为心肌细胞凋亡所致[2]。有研究证实：促红细胞生成素(erythropoietin，EPO)具有抗凋亡、抗炎、抗氧化作用，并对心、脑、脊髓等脏器均具有明显的细胞保护作用，是近来国内外研究的热点[3]。亦有新近研究指出EPO的衍生物氨甲酰化促红细胞生成素(carbamylated erythropoietin，CEPO)具有与EPO近乎同等的组织保护作用，不会促进造血，从而减少了血液淤积、血压升高、血栓形成等不良反应的发生，具有更广阔的临床应用前景[4]。但就目前而言，CEPO治疗CHF的相关研究尚少见报道。本研究通过建立大鼠CHF模型并予以CEPO干预，观察心脏功能指数、心肌细胞组织形态、心肌细胞凋亡率以及凋亡相关基因活化型Caspase-3(cleaved Caspase-3)蛋白的表达，探讨CEPO调节Caspase-3活化表达对CHF大鼠的心肌保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 动物 8周～12周龄SPF级成年雄性SD大鼠共36只，体重(235.26±10.15)g，购自南方医科大学实验动物中心。所有大鼠均在相同的条件下饲养，自由饮水和取食。饲料购自南方医科大学实验中心。

1.1.2 药品及试剂 CEPO由广州医科大学药学研究室合成，TUNEL试剂盒购自Roche公司，β-actin抗体购自ProteinTech Group，Inc(USA)，cleaved Caspase-3抗体购自Cell Signaling Technology(USA)。

1.2 方法

1.2.1 分组及模型建立 36只成年雄性SD大鼠随机选取10只为假手术(Sham)组，其余大鼠行腹主动脉缩窄术建立CHF模型。手术前禁食24 h并称重，10%水合氯醛(3 mL/kg)经腹腔注射麻醉，逐层打开腹腔、暴露左肾静脉，取左肾静脉和下腔静脉交点上方15 mm～20 mm处钝性分离筋膜后暴露腹主动脉，用4-0丝线穿过分离的腹主动脉，在腹主动脉上平行放置磨钝后的7号输液针头(直径0.7 mm)，结扎丝线后马上拔除针头，拔针时以稍有紧箍感为宜，此时可使腹主动脉缩窄达60%～70%，收纳脏器，逐层关闭腹腔。待大鼠从麻醉中苏醒后即经腹腔注射阿米卡星(0.2 mL/d)抗感染，连续3 d。术后正常饲养并观察8周，制成CHF模型。Sham组在分离的腹主动脉相同部位穿线但不结扎，余建模流程同上。

1.2.2 模型分组和干预 术后第8周，将造模成功的存活CHF大鼠用随机数字表法平均分为CEPO组(n=10)和Control组(n=10)，其中CEPO组大鼠经腹腔注射CEPO(50 μg/kg)，3次/周，连续4周[4]。Control组及Sham组大鼠经腹腔同期注射等量0.9%氯化钠溶液。给药期间各组大鼠无死亡。

1.2.3 心脏彩超检查 在术后第8周、12周行心脏彩超观察大鼠心功能。大鼠禁食24 h后，10%水合氯醛经腹腔注射(3 mL/kg)麻醉、备皮并仰卧位固定，应用超声心动仪(ie33型号，PHILIPS公司)及7.5 MHz高频线控探头(PHILIPS公司)进行心脏功能检测。分别检测左室射血分数(LVEF)、舒张末期室间隔厚度(IVSd)、舒张末期左心室后壁厚度(LVPWd)、收缩末期室间隔厚度(IVSs)、收缩末期左心室后壁厚度(LVPWs)。

1.2.4 心肌组织处理 术后第12周末待全部大鼠完成心脏彩超检测后，10%水合氯醛(3 mL/kg)经腹腔注射麻醉，暴露胸腔，剔除心外膜，剪取心尖部5 mm×5 mm×5 mm心肌组织，放入预冷至4 ℃的PBS溶液中冲洗至溶液澄清，置于液氮中速冻后存于-80 ℃超低温冰箱，待分子生物学实验使用；左心室插管至主动脉并固定，剪开右心耳，以预冷至4 ℃的生理盐水溶液快速灌流约3 min至右心耳流出无色澄清液体，再以4%多聚甲醛溶液灌注固定20 min～30 min后剪取心脏，置于4%多聚甲醛缓冲液固定24 h，常规制备石蜡切片，厚度3 μm～4 μm，待用。

1.2.5 病理检查 从经上述步骤制成的石蜡切片中，每组随机选择3张切片，采用苏木精-伊红(HE)染色后置于200 倍光镜下观察各组心肌组织细胞形态结构及炎症细胞浸润情况。

1.2.6 TUNEL原位末端标记法检测细胞凋亡 从石蜡切片中，每组随机选择3张切片，按照TUNEL试剂盒操作说明处理，在镜下观察阳性凋亡细胞并摄取图像，再进行DAB染色，每张切片在高倍镜(×400)下随机读取6个不重叠视野，细胞核染成深棕色者计为阳性细胞。计数后，计算细胞凋亡指数(AI)=单视野凋亡阳性细胞数/单视野总细胞计数×100%，取其平均值进行统计分析。

1.2.7 Western blot法测定cleaved Caspase-3蛋白表达 心肌组织经研磨、裂解后用酶标仪测定蛋白浓度，上样总蛋白质量定为120 μg，经SDS-PAGE凝胶电泳分离后，采用电印迹转移法，将目标蛋白转至PVDF膜，再用丽春红S染色，根据所需目标分子量剪膜，用含5%脱脂奶粉的TBS-T溶液在室温中封闭2 h后，分别加入兔抗Caspase-3抗体和β-actin抗体，4 ℃孵育过夜，在室温下用TBS-T溶液洗膜，充分洗膜后加入兔(鼠)二抗孵育2 h，用TBS-T溶液洗膜后与ECL试剂反应5 min，胶片曝光并扫描图像，用Quantity One软件计算条带光密度(OD)值，以cleaved Caspase-3与β-actin条带的OD积分比值来评定的cleaved Caspase蛋白的表达水平。

2 结 果

2.1 心脏彩超结果 术后第4周，Sham组与建模组大鼠LVEF差异无统计学意义(P>0.05)；建模组LVPWd、IVSd、LVPWs、IVSs显著升高(P<0.05)，表明Control组大鼠心脏发生心肌肥厚。术后第8周，Control组大鼠LVEF显著下降(P<0.05)，LVPWs、IVSs、LVPWd、IVSd仍高于Sham组(P<0.05)，表明Control组大鼠经结扎缩窄腹主动脉后发生心力衰竭，CHF模型建立成功。术后第12周，相比Sham组(见图1A)，Control组大鼠LVEF进一步下降(P<0.05)，LVPWs、IVSs、LVPWd、IVSd进一步增高(P<0.05)，详见图1B。侧面反映Control组大鼠心力衰竭进一步加重。与Control组比较，EPO组大鼠LVEF明显增加(P<0.05)，LVPWs、IVSs、LVPWd、IVSd明显降低(P<0.05)，表明EPO干预CHF大鼠能够逆转其心室肥厚、改善心功能。详见图1C、表1。

图1各组大鼠超声心动图

组别时间nLVPWs(cm)IVSs(cm)LVPWd(cm)IVSd(cm)LVEFSham组8周100.285±0.0210.268±0.2620.194±0.1550.163±0.1470.897±0.57312周100.321±0.0150.295±0.0230.207±0.0100.185±0.0950.882±0.451Control组8周100.393±0.0161)0.349±0.4201)0.295±0.2471)0.227±0.2310.731±0.1911)12周100.451±0.0121)0.372±0.0101)0.309±0.0101)0.304±0.0201)0.643±0.2981)CEPO组12周100.367±0.1112)0.326±0.232)0.245±0.0202)0.217±0.0102)0.782±0.3451)2) 与同期Sham组比较,1)P<0.05;与Control组比较,2)P<0.05。

2.2 HE染色结果 Sham组大鼠心肌细胞染色清晰、排列整齐而紧密，结构完整，细胞核致密、清晰可见，呈椭圆形或长杆形，显蓝色。Control组心肌细胞较肥大，细胞间间隙增宽，排列紊乱，可见间质增生、纤维化，细胞核着色不均，心肌肌节增多、肌纤维间疏松水肿。相比Control组，CEPO组心肌细胞排列紊乱、间质增生水肿及炎性细胞浸润、聚集的表现有所减轻。详见图2。

Sham组 Control组 CEPO组

2.3 心肌细胞凋亡的变化 Sham组细胞核染为蓝色，清晰可见，边界清楚。Control组可见大量棕色深染的固缩、聚集呈棒状的细胞核(箭头所示)，为发生凋亡的细胞核。EPO组深染棕色细胞核较Control组明显减少。详见图3。与Sham组比较，Control组AI显著升高；与Control组比较，CEPO组AI相对下降，但仍高于Sham组(P<0.05)。详见表2。

图3 光镜下心肌细胞凋亡组织切片(TUNEL，×400)

2.4 Western blot法检测心肌cleaved Caspase-3蛋白表达 与Sham组比较，Control组cleaved Caspase-3/β-actin OD值明显升高；CEPO组cleaved Caspase-3 OD值相比Control组显著降低，但高于Sham组(P<0.05)。详见图4、表2。

图4 Western blot检测各组大鼠术后第12周心肌cleaved Caspase-3蛋白的表达

组别ncleavedCaspase-3/β-actinAI(%)Sham组100.3042±0.00178.91±0.18Control组100.9021±0.04141)30.15±0.671)CEPO组10 0.4891±0.02911)2) 21.33±2.531)2) 与同期Sham组比较,1)P<0.05;与Control组比较,2)P<0.05。

3 讨 论

近年来不断有研究证实[5-6]，细胞凋亡作为一种有别于细胞坏死的程序性死亡现象，在慢性心力衰竭发生、发展过程中扮演着重要的角色。心肌细胞属于终末分化细胞，在病理过程中心肌细胞凋亡程序被激活时，大量心肌细胞死亡可造成数量永久减少，当数量减少至某一阈值时存活的心肌细胞不足以完全代偿维持心脏正常的舒缩功能，引致心室壁变薄、心肌肥大、心腔扩大等器质性病变，最终发展为心力衰竭。和非心肌细胞类似，心肌细胞凋亡发生的信号传导通路主要有两条[7]：一条是通过胞外信号激活细胞内的Caspase家族蛋白酶，一条是通过线粒体释放凋亡酶激活因子使Caspase家族蛋白酶活化。这些活化的Caspase家族蛋白酶可将细胞内的重要蛋白降解，最终引起细胞凋亡。由此可见这两条凋亡途径共同的关键环节是Caspase家族蛋白酶的激活。Caspase家族是一组同型半胱氨酸门冬氨酸蛋白酶，通过蛋白酶级联反应顺序激活，在细胞凋亡的执行过程中起着关键作用，其中Caspase-3是Caspase家族中最重要的凋亡执行因子，它由28 kD的酶原经酶解作用生成由17 kD、12 kD 两个亚单位组成的异二聚体，是细胞凋亡早期阶段激活的关键蛋白酶，在细胞凋亡过程中起中心环节作用，故也被称为死亡蛋白酶，是目前已知的凋亡最终执行因子[8]。以往的研究显示：Caspase-3通常以无活性的 Caspase-3前体(pro Caspase-3)存在的，当细胞受到凋亡信号激活或各种外界有害物质刺激时，Caspase-3转变为有活性的Caspase-3，又称为活化型Caspase-3(cleaved Caspase-3)，活化型Caspase-3具有成熟酶的性质，标志着细胞凋亡进入不可逆阶段。其主要作用机制是消化破坏细胞内多种蛋白酶复合体，激活核内核酸酶，造成DNA裂解，形成DNA片段，破坏细胞钙泵功能，发生细胞内钙超载，导致最终的细胞凋亡[9]。

从本研究结果可以看出，CHF建模成功的Control组大鼠在术后第12周时行western蛋白印迹检测观察到cleaved Caspase-3蛋白表达水平较Sham组显著升高(P<0.05)，与此同时TUNEL检测可观察到Control组大鼠凋亡细胞数量较Sham组明显增加(P<0.05)。心脏彩超检测结果也显示，相比假手术组，术后第12周Control组大鼠的心室肌明显肥厚，射血分数显著下降(P<0.05)，提示CHF大鼠心室重塑、心脏舒缩功能下降，发生心力衰竭。这和以往的相关研究结果一致[10]。因此，阻断心肌细胞凋亡的信号转导通路，抑制Caspase-3活化，减少cleaved Caspase-3表达水平有助于阻遏凋亡的发生，这将是今后防治心力衰竭的主要途径之一。

传统的CHF治疗药物包括血管紧张素转换酶抑制剂、β受体阻断剂、利尿剂及强心苷类药物等。但上述药物均各自存在药物不良反应和疗效不佳的问题，因此，寻找出一种更广泛适用的抗慢性心力衰竭药物是国内外研究的热点。EPO是一种由肾脏(少量来自于肝脏)合成和分泌的糖蛋白生长因子，主要治疗肾性贫血。新近研究证实，EPO在心血管疾病上发挥着细胞保护作用，这些有利作用的机制仍尚未可知，但可能和抗凋亡、抗氧化、促进新生血管生成有关[11]。但是，EPO发挥细胞保护的剂量要远远大于治疗贫血时的剂量，长期大剂量应用EPO可能造成对骨髓造血系统的过度刺激，进而导致红细胞增多症、高血压及血栓形成等不良作用。因此，在保留EPO细胞保护功能的前提下去除其促红细胞生成作用的衍生物研发是近期研究的热点之一。Leist[12]通过用KCNO使EPO氨甲酰化的化学方法制成了CEPO。与EPO相比，CEPO并没有促红细胞生成的作用，但具有与EPO相似的药物代谢动力学特性，同时有研究报道CEPO具有与EPO相同的细胞保护作用。

本研究制备了CHF大鼠模型并予以CEPO干预，探讨CEPO对CHF大鼠心肌的保护作用。结果显示：相比对照组，经CEPO干预的CHF大鼠心肌细胞凋亡的数量明显减少，心肌组织cleaved Caspase-3蛋白表达水平下降。提示CEPO能减少关键凋亡酶蛋白Caspase-3的活化，抑制具有生物功能的cleaved Caspase-3产生，从而减少了心肌凋亡的数量并起心肌细胞保护作用，对CHF的治疗发挥着积极的作用。然而，CEPO减轻心肌凋亡的具体机制及是否存在其他远期不良反应尚未阐明，有待进一步研究。

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(本文编辑郭怀印)

Effects of Carbamylated Erythropoietin on the Apoptosis and Cleaved Caspase-3 Protein in Rat with Chronic Heart Failure

Huang Zhaoqi，Wu Jinlei，Xu Wei，Chen Yongquan，Xie Wenjie，Chen Ximing，Chen Shengqiang

The Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University，Guangzhou 510150，China

ObjectiveTo observe the effects of cardiomyocytes carbamylated erythropoietin (CEPO) on the cardiac function,the apoptosis of cardiomyocytes，protein cleaved cysteine-containing aspartate-specific proteases (cleaved Caspase-3) expression in rats with chronic heart failure(CHF).MethodsFirstly，30 male adult SD rats were randomly divided into three groups，sham-operated (Sham) group (n=10)，CEPO group (n=10) and control (Control) group (n=10).CHF model was built by abdominal aortic coarctation.After postoperative eight weeks，rats in CEPO group

50 μg / kg CEPO by intraperitoneal injection 3 times / week for 4 weeks.The rats in Sham group and Control group received equal normal saline.Respectively，after 8 weeks and 12 weeks，cardiac function was observed with echocardiography.After 12 weeks，all rats were sacrificed，cell morphology was observed by HE staining.The myocardial apoptosis and calculated apoptosis index (AI)；was observed Myocardial cleaved Caspase-3 protein expression was observed by western blot.ResultsEchocardiography showed CHF rats had ventricular hypertrophy and heart failure in 8 weeks.CEPO intervention after 4 weeks compared with Control group，left ventricular ejection fraction (LVEF) was significantly higher (P<0.05)，systolic interventricular septum thickness (IVSs)，end-systolic left ventricular posterior wall thickness (LVPWs)，diastolic interventricular septum thickness (IVSd)， left ventricular end-diastolic wall thickness (LVPWd) was significantly lower (P<0.05).AI in CEPO group was significantly lower than that in Control group[(23.87±1.45)% vs(30.15±0.67)%，P<0.05].The cleaved Caspase-3 OD values significantly decreased in CEPO group (0.489 1±0.029 1) with Control group (P<0.01).ConclusionCEPO can improve heart function in rats with CHF the cardiomyocyte apoptosis，by down-ragulating the express of cleaved Caspase-3 protein.

heart failure；carbamylated erythropoietin；cardiac apoptosis；cleaved Caspase-3 protein

广东省科技厅基金项目(No.2013B022000103)

1.广州医科大学附属第三医院(广州 510150)，E-mail：huangzhaoqi34@163.com；2.广州医科大学附属第二医院

信息：黄兆琦，伍金雷，许卫，等.氨甲酰化促红细胞生成素对慢性心力衰竭大鼠心肌细胞凋亡及cleaved Caspase-3蛋白表达的影响[J].中西医结合心脑血管病杂志，2017，15(16)：1974-1978.

R541.6 R256.2

：Adoi：10.3969/j.issn.1672-1349.2017.16.007

：1672-1349(2017)16-1974-05

2017-03-13)