血必净联合法舒地尔对脓毒症急性肾损伤后肾小管细胞凋亡的影响

孙雪东 严一核 刘芳 褚韦韦 张亦婷 应利君

血必净联合法舒地尔对脓毒症急性肾损伤后肾小管细胞凋亡的影响

孙雪东 严一核 刘芳 褚韦韦 张亦婷 应利君

目的 探讨早期应用血必净联合法舒地尔对脓毒症急性肾损伤后肾小管细胞凋亡的影响及机制。方法 将60只雄性SD大鼠随机分为分假手术组、脓毒症组、血必净组、法舒地尔组和联合用药组，每组12只。以盲肠结扎穿孔法制造脓毒症模型，假手术组麻醉后开腹翻动肠道，随即关腹；脓毒症组按4ml/kg尾静脉注射0.9%氯化钠注射液；血必净组按4ml/kg注射血必净；法舒地尔组按20mg/kg注射盐酸法舒地尔；联合用药组予等剂量血必净和法舒地尔注射。在造模后6、24h再将每组随机分为2个亚组，每个亚组6只。检测各时间点大鼠的肾功能和炎症指标，观察肾小管病理改变、测定肾小管损伤评分，采用TUNEL法观察肾小管凋亡细胞，并计算凋亡指数(AI)。用免疫印迹法测定ROCK-1、MYPT-1和caspase-3表达的变化。结果 （1）造模后24h时与脓毒症组相比，各用药组肾功能均能明显改善（P＜0.05），在抑制TNF-α、IL-6表达上联合用药组优于两单药组（均P＜0.05）。（2）造模后24h时联合用药组与两单药组比较，肾小管损伤评分和AI值明显降低（均P＜0.05）。（3）造模后24h时联合用药组与两单药组比较，更能抑制MYPT-1的磷酸化，促使caspase-3表达下降（均P＜0.05）。结论 脓毒症早期血必净联合法舒地尔可以通过Rho/ROCK信号通路抑制凋亡蛋白的表达，减少肾小管细胞在脓毒症进程中的凋亡，发挥协同作用减轻脓毒症导致的急性肾损伤。

血必净 法舒地尔 脓毒症急性肾损伤凋亡 Rho激酶

严重脓毒症往往引起多脏器功能不全，患者病死率高达25%～80%[1]，在ICU中是导致患者死亡的主要原因之一。近年来，细胞凋亡通路的激活被认为是导致脓毒症急性肾损伤的重要原因，Rho被认为是细胞内信号传递的分子启动因子[1-2]；阻断该信号通路可以减少炎性介质的生成，减轻炎性反应和细胞的凋亡。而血必净注射液可以通过抑制脓毒症时失控的炎症反应，减少细胞的凋亡和组织的氧化损伤，被广泛应用于脓毒症的临床治疗[2]；法舒地尔是目前唯一应用于临床的Rho酶抑制剂，能改善微循环，可扩张入球小动脉和收缩出球小动脉，使肾小球滤过率增加，同时通过Rho/ROCK通路抑制细胞的凋亡，改善内毒素所致的急性肾损伤后肾功能和肾脏病理改变，减轻炎性反应[3]。由于临床上少有两药联用的报道，因此笔者将血必净联合法舒地尔应用于脓毒症急性肾损伤大鼠模型，观察两者在Rho/ROCK信号通路上对脓毒症急性肾损伤的作用和对肾小管细胞凋亡的影响，以及两药联用可否起到协同作用，并探讨其可能的作用机制，现将结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 清洁级SD大鼠60只，体重180～220g，由浙江大学医学院实验动物中心提供和饲养；合格证号: SYXK（浙）2010-0126。实验造模前适应性饲养1周。血必净注射液（天津红日公司，10ml/支），盐酸法舒地尔射液（天津红日公司，30mg/支）。ELISA法试剂盒（上海生化公司）。原位细胞凋亡检测（TUNEL）试剂盒、DAB试剂盒（上海生化公司），免疫组化试剂盒：ROCK-1（英国Abcam公司）、caspase-3（美国Cell Signal公司）、p-MYPT-1（英国Abcam公司）、total-MYPT-1（英国Abcam公司）、β-actin（美国Santa Cruz公司）。

1.2 动物模型的制作和分组 参照文献[5]以盲肠结扎穿孔法（cecalligation and puncture,CLP）制造脓毒症模型，以随机数字表法分成假手术组、脓毒症组、血必净组、法舒地尔组和联合用药组，每组12只；对各组分别以造模后6、24h作为观察点再以随机数字表法分为2个亚组，每个亚组6只。CLP后0.5h大鼠出现精神软弱、活动减少、毛色杂乱无光泽、呼吸稍促、喜饮水、解稀便，说明动物模型制作成功[5-6]。假手术组麻醉后开腹翻动肠道，随即关腹；脓毒症组CLP后0.5h尾静脉按4ml/ kg注射0.9%氯化钠注射液；血必净组CLP后0.5h尾静脉按4ml/kg注射血必净；法舒地尔组CLP后0.5h尾静脉按20mg/kg注射盐酸法舒地尔；联合用药组予等剂量血必净和法舒地尔尾静脉注射。首次给药后每12h重复给药1次。所有大鼠在手术后均常规予以注射30ml/kg 的0.9%氯化钠注射液复苏。

1.3 生化和炎症指标的检测 在造模后6、24h用戊巴比妥50mg/kg经大鼠进行腹腔注射麻醉，剖腹暴露肾脏，并经腹主动脉采血、切取肾脏标本。用全自动生化仪（日本日立7600）检测血肌酐（Cr）、血尿素氮（BUN）。用ELISA法检测血液中TNF-α、IL-6水平，按说明书操作。

1.4 病理组织学检测 对肾脏组织常规用10%甲醛溶液固定、脱水、石蜡包埋、切片和HE染色。在光镜下观察肾组织的病例变化，进行肾脏肾小管损伤评分的评定，作半定量分析。肾损伤定义为：肾小管退化、空泡变性，管型形成，小管坏死和炎症浸润。评分标准：0分，正常组织；1分，单细胞、点灶性坏死；2分，肾小管受损面积≤25%；3分，肾小管受损面积26%～50%；4分，肾小管受损面积51%～75%；肾小管受损面积≥76%[5]。

1.5 TUNEL法测定肾小管凋亡细胞 采用TUNEL试剂盒并按试剂盒的说明进行操作来检测凋亡的DNA碎片：将石蜡切片脱蜡脱水，用蛋白酶K孵育，微波修复抗原，滴加TUNEL反应液，滴加辣根过氧化物酶标抗荧光素抗体工作液，用DAB显色剂呈色；最后脱水、透明、封片。在光镜下观察，细胞核呈棕黄色，即为阳性细胞。每视野内阳性细胞占总细胞数的百分率即为凋亡指数（apoptotic index，AI），即AI＝阳性细胞/总细胞数× 100%。采用Image-Pro Plus-6.0软件对图像的AI进行盲法分析。

1.6 免疫印迹法测定ROCK-1、MYPT-1和caspase-3的表达 取新鲜肾脏髓质40mg在400μl的RIPA裂解液（50 mMTris-HCl pH 7.4，150 mMNaCl，1mM PMSF，1%NP-40）中进行匀浆，然后在4℃下进行12 000r/min离心15min×2，除去未破裂的细胞、细胞核和线粒体。细胞上清液转移到新的试管，测定总蛋白浓度。所有细胞上清液调整到相同的蛋白浓度，并在SDS缓冲液65℃中加温15min，保存于-20℃备用。进行SDS-PAGE电泳、转膜，用一抗ROCK-1（1∶1 000）、caspase-3（1∶800）、p-MYPT-1（1∶1 000）、total-MYPT-1（1∶500）、β-actin（1∶2 000）孵育过夜，最后用二抗（兔抗鼠，1∶500）孵育2h，ECL试剂显色，JY-Clear ECL型化学发光凝胶成像分析系统进行成像。ROCK-1、caspase-3的表达用各自蛋白的表达与内参β-actin比值表示，MYPT-1的表达用p-MYPT-1/total-MYPT-1比值表示。

1.7 统计学处理 应用SPSS 17.0统计软件，计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法。

2 结果

2.1 各组大鼠不同时点肾功能变化和炎症指标的比较各组大鼠造模6h后Cr、BUN水平比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）；24h后各组大鼠Cr、BUN水平比较差异均有统计学意义（均P＜0.05），且24h后脓毒症组Cr水平明显高于假手术组（P＜0.05），各用药组Cr水平明显低于脓毒症组（P＜0.05），但3组用药组间的Cr水平无统计学差异；联合用药组BUN水平均低于其他单药组（P＜0.05），而两单药组与脓毒症组比较无统计学差异。各组大鼠6、24h后TNF-α、IL-6水平比较差异均有统计学意义（均P＜0.05）；各用药组6、24h后TNF-α、IL-6水平均低于脓毒症组（均P＜0.05），联合用药组低于两单药组（P＜0.05），但两单药组之间比较差异无统计学意义（P＞0.05），详见表1。

表1 各组大鼠不同时点肾功能变化和炎症指标的比较

2.2 各组大鼠肾组织病理改变和肾小管损伤评分的比较 假手术组肾小管病理基本正常；脓毒症组见明显肾小管坏死，透明管型并伴有大量单核细胞浸润；血必净组、法舒地尔组肾小管空泡变性减少，单核细胞浸润明显减少；联合用药组局部肾小管空泡变，详见图1（见插页）。各组大鼠造模6、24h后肾小管损伤评分比较差异均有统计学意义（均P＜0.05）；脓毒症组造模6h后肾小管损伤评分高于假手术组（P＜0.05），联合用药组评分明显低于脓毒症组（P＜0.05）；其余各组比较无统计学差异。24h时脓毒症组和各用药组评分均高于假手术组（均P＜0.05），两单药组与脓毒症组比较无统计学差异，但联合用药组明显低于脓毒症组（P＜0.05）,详见表2。

2.3 TUNEL法检测肾小管凋亡细胞 结果显示，假手术组无凋亡细胞；脓毒症组显示簇状、队列状排列的凋亡细胞；血必净组和法舒地尔见分散分布的凋亡细胞，联合用药组见少量分散队列状凋亡细胞，提示脓毒症导致肾小管细胞的凋亡，详见图2（见插页）。各组大鼠造模6h后AI比较无统计学差异（P＞0.05），24h后差异有统计学意义（P＜0.05）。各用药组造模24h后AI值均明显低于脓毒症组（均P＜0.05），联合用药组均低于两单药组（均P＜0.05），两单药组间比较差异无统计学意义（P＞0.05），详见表3。

表2 各组各时点肾小管损伤评分的比较（分）

表3 各组大鼠肾小管凋亡情况的比较（%）

2.4 各组大鼠ROCK-1、MYPT-1和caspase-3表达的比较 各组大鼠造模6h后ROCK-1、MYPT-1比较均无统计学差异（均P＞0.05），而capase-3在各组中有统计学差异（均P＜0.05）；造模24h后各组ROCK-1、MYPT-1和caspase-3的表达比较差异均有统计学意义（均P＜0.05）。造模6h后capase-3表达在各用药组低于脓毒症组（P＜0.05），联合用药组低于两单药组（P＜0.05）。造模24h后ROCK-1在各用药组的表达高于脓毒症组（P＜0.05），但各用药组间比较无统计学差异；MYPT-1和caspase-3在联合用药组的表达低于脓毒症组，且低于两单药组（P＜0.05），见表4、图3。

3 讨论

脓毒症是感染后导致的全身炎症反应综合征，严重脓毒症可导致多器官功能障。根据临床治疗和文献报道，脓毒症发生6h后可检测到血清中多种炎症介质增高，如果6h内有效的集束化治疗可以明显改善脓毒症预后，24h后临床指标明显改善，大大增加患者的生存率[4]；因此本研究选用造模后6、24h两个时点予以观察。研究表明，近半数的脓毒症患者在病程中出现脓毒性急性肾损伤（SI-AKI）使患者病死率成倍增加甚至高达75%[1-2]。目前细胞凋亡通路的激活被认为是导致早期急性脓毒性肾损伤的重要原因[5]，本研究从中药血必净联合法舒地尔入手，从Rho/ ROCK信号通路来探讨对SI-AKI的肾小管细胞凋亡的保护作用。

表4 各组大鼠各时点ROCK-1、MYPT-1和caspase-3的表达

图3 各组大鼠造模24h后ROCK-1、MYPT-1和caspase-3的表达

凋亡是指程序性死亡，是一个清除坏死和异常细胞的自我保护机制。Rho相关激酶ROCK是丝氨酸/苏氨酸相关的异构体，被认为是Rho蛋白的效应蛋白，在细胞凋亡的起始阶段发挥重要作用[6-7]。ROCK蛋白广泛存在与哺乳动物内，包括ROCK-1和ROCK-2；ROCK-1主要存在与肝、肾、睾丸等非神经组织[8]。ROCK通过磷酸化下游肌球蛋白结合亚基磷酸酶靶蛋-1(MYPT-1)从而实现细胞调节功能[9]。同时，caspase-3是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶，在细胞凋亡阶段体内caspase-3可以使ROCK-1发生构象性改变，导致ROCK-1处于持续性活化状态[10-11]。抑制capase-3、MYPT-1的表达可以减少效应蛋白ROCK-1的表达，从而减少肾小管细胞的凋亡，改善肾脏灌注和肾功能有重要意义[12]。

血必净是在“菌、毒、炎”并治的理论指导下研制而成的水性注射液，能抑制多种细胞炎症因子；主要成分有川芎、赤芍、丹参、红花等提取物，具有行气活血、清热凉血、解毒止痛的功效，能扩张外周微血管，具有改善组织灌注与微循环，能抑制过度的炎性介质释放[13-14]。而法舒地尔是目前唯一应用于临床的ROCK抑制剂，有抑制钙敏化效应，利于血管平滑肌的舒张，可扩张入球小动脉和收缩出球小动脉，使肾小球滤过率增加，同时降低炎性介质的形成，能减轻炎性反应，减少氧自由基的生成[15-16]。同时国内学者瞿星光等[4]通过实验认为法舒地尔可以改善内毒素所致的急性肾损伤后肾功能和病理损伤减轻炎性反应；通过直接抑制ROCK-l活性，并下调GRP78、CHOP等炎症蛋白，抵抗内质网过度应激所致的损伤[3，15]。本研究免疫印迹法测定结果发现：脓毒症发生后MYPT-1磷酸化增加、caspase-3表达不断增强，导致ROCK-1处于持续激活状态，从而产生一系列的病理性损害；血必净和法舒地尔应用24h时均可以减少MYPT-1的磷酸化，阻止ROCK-1在脓毒症中的过度表达，同时可以使caspase-3表达降低。从炎症因子角度出发，两药联用在脓毒症早期6h时，即可抑制TNF-α、IL-6的表达；从生化和组织学上来看，在脓毒症发生后各用药组24h时均能明显改善肾功能的恶化，减轻肾脏组织学的形态学改变；从TUNEL免疫染色来看能够明显减少肾小管细胞的凋亡。但两药联用对抑制caspase-3、MYPT-1的表达和降低AI值来看可协同发挥作用，更好地抑制肾小管细胞的凋亡。这些证据表明血必净能够通过Rho激酶通路抗肾小管细胞的凋亡。

综上所述，笔者认为Rho/ROCK通路与脓毒症性急性肾损伤密切相关，早期联合应用血必净和法舒地尔可以改善脓毒症导致急性肾损伤的病理学改变，减少肾小管细胞在脓毒症进程中的凋亡。单味中药往往疗效甚微，和法舒地尔联用充分发挥了中西医结合的协同效应[17-18]，为两药联用治疗SI-AKI提供了实验依据；但对于临床的应用仍然有待进一步的深入研究。

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Inhibitory effects of Xuebijing injection combined with fasudil on tubular apoptosis in sepsis-induced acute kidney injury of rats

SUN Xuedong,YAN Yihe,LIU Fang,et al.Department of Critical Care Medicine,Shaoxing People's Hospital,Shaoxing 312000,China

Objective To investigate the effect of Xuebijing combined with fasudil on tubular apoptosis in sepsis-induced acute kidney injure(SI-AKI)of rats. Methods Sixty male SD rats were randomly divided into five groups:sham group,sepsis group,Xuebijing group,fasudil group and combination group with 12 rats in each group.Sham operation was performed in rats of sham group;SI-AKI were induced by cecal ligation and puncture(CLP)surgery in other 4 groups.0.9%sodium chloride at 4ml/kg,Xuebijing at 4ml/kg,fasudil at 20mg/kg and Xuebijing with fasudil were injected via caudal vein in sepsis group,Xuebijing group,fasudil group and combination group,respectively.Six rats were sacrificed in each group at 6h and 24h after treatment, respectively.Renal function parameters,inflammation factors,pathological changes of tubules,renal tubular injury score were measured.The apoptosis of renal tubular cells was determined by TUNEL method,apoptotic indices (AI)were calculated.The expressions of ROCK-1,MYPT-1 and caspase-3 were detected by Western blot. Results At 24h after treatment,the renal function in 3 treatment groups was significantly improved compared to sepsis group (P＜0.05).The TNF-α,IL-6 levels in combination group were lower than those in other two treatment groups(all P＜0.05).The tubular damage scores and AI values in combination group were more attenuated compared to other two treatment groups(all P＜0.05).The phosphorylation of MYPT-1 was more markedly inhibited and the caspase-3 expression was decreased in combination group compared to other two treatment groups(all P＜0.05). Conclusion Early application of Xuebijing combined with fasudil can alleviate renal dysfunction and pathological changes,reduce the tubular cell apoptosis in SI-AKI rats,in which the Rho-kinase signaling pathway may be involved.

Xuebijing FasudilSepsis acute kidney injury apoptosis Rho-kinase

2016-09-19）

（本文编辑：严玮雯）

绍兴市科技计划（2014B70066）

312000 绍兴市人民医院重症医学科（孙雪东、严一核、褚韦韦、张亦婷、应利君），病理科（刘芳）

孙雪东，E-mail：drsxd@tom.com