法舒地尔复乳的制备及质量评价

李秀英，赵 婧，侯倩宜，高腾美，王颖莉

（山西中医药大学，山西 晋中030619）

法舒地尔是一种蛋白激酶抑制剂，其在正常或病理情况下都能竞争性结合Rho 激酶催化区的ATP 位点，阻断Rho 激酶的活性。法舒地尔注射液在临床中常用于蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛等引起的缺血性脑血管疾病症状的改善。研究发现法舒地尔能改善动脉粥样硬化患者的内皮功能，减少动脉粥样斑块，而且可以有效扩张血管，改善心力衰竭状况，因此可以用于多种老年病的防治［1-2］。该类慢性病需长期治疗，注射剂已不

能满足临床用药需求，有必要开发更为适宜的口服制剂。复乳是一种良好的药物载体，药物被油膜包裹后可减少其在胃肠道的水解，降低副作用，增加吸收；并且具有一定的缓释和靶向作用，可增强药效，所以将复乳剂型应用于法舒地尔口服给药是解决水溶性法舒地尔口服代谢快、绝对生物利用度低（10.2%）［3］的一种潜在制剂手段。

1 实验材料

1.1 实验仪器

Waters e2695 型高效液相色谱仪，2998 PDA检测器，Agela Innoval C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），JA5003 分析天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司），78-1 型磁力加热搅拌器（江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司），TGL18M 冷冻超高速离心机（湖南湘立科学仪器有限公司），雷磁DDS-11C 型电导率仪（上海仪电科学仪器股份有限公司），CX22 奥林巴斯显微镜，Zetasizer 3000 马尔文激光散射粒径测定仪（英国马尔文公司）。

1.2 实验试药

盐酸法舒地尔（Ark pharm 公司，批号：WG0130021-160517001，含量98%），蛋黄卵磷脂（EPC，上海如吉生物科技发展有限公司，批号160116），维生素E 聚乙二醇琥珀酸酯（TPGS，上海谱振生物科技有限公司，批号ZY161029），蓖麻油（天津市耀华化学试剂有限责任公司），司班80（Span-80）、吐温80（Tween 80）、磷酸二氢钾溶液、氯仿（天津市科密欧化学试剂有限公司），乙腈、甲醇（色谱纯，广州艾欣科学仪器有限公司）。

2 方法与结果

2.1 法舒地尔分析方法学的建立

2.1.1 色谱条件 色谱柱：Agela Innoval C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：0.05 mol/L 磷酸二氢钾溶液（用1 mol/L 的氢氧化钠调节pH 至5.0）-甲醇=84∶16；流速：1.0 mL/min；检测波长：218 nm；进样量：20 μL［4］。

2.1.2 法舒地尔复乳供试品溶液制备 精密称定法舒地尔复乳1.0 g，流动相超声溶解后定容至10 mL，过滤，取续滤液2 mL 以流动相稀释至10 mL，成为每毫升含0.02 g 的供试品溶液备用。

2.1.3 空白复乳供试品溶液制备 按照空白复乳的制备工艺，制备不含法舒地尔的空白复乳，并用2.1.2 项下方法制得相应的空白复乳供试品溶液。

2.1.4 法舒地尔系列标准溶液的配制 精密称取5.03 mg 法舒地尔原料药，置于25 mL 锥形瓶中，用蒸馏水定容至刻度，使其完全溶解，即得200.12 μg/mL 法舒地尔母液。分别精密移取法舒地尔母液0.10 mL、0.25 mL、0.50 mL、1.00 mL、2.50 mL、5.00 mL 置10 mL 容量瓶中，用流动相定容至刻度，摇匀，即可得到1.00 μg/mL、2.00 μg/mL、5.00 μg/mL、10.01 μg/mL、20.01 μg/mL、50.03 μg/mL、100.06 μg/mL 法舒地尔系列标准溶液，过0.45 μm 微孔滤膜，滤过，取续滤液，即得。

2.1.5 系统适应性 精密吸取标准品、空白复乳及法舒地尔复乳供试液各20 μL，按照上述“2.1.1”色谱条件进样分析。法舒地尔色谱峰出现在5.7 min，空白复乳在相应保留时间无色谱峰，因此空白复乳对法舒地尔无干扰。色谱图见图1。

图1 HPLC 色谱图

2.1.6 线性关系考察 精密吸取上述法舒地尔系列标准溶液20 μL，按照上述色谱条件，测得峰面积（A），计算回归方程A=71 098C-21 802，r=0.999 9，法舒地尔在1.00～100.06 μg/mL 范围内线性关系良好。

2.1.7 精密度实验 精密吸取上述标准溶液（10.01 μg/mL）20 μL，按照上述色谱条件，连续进样6 次，法舒地尔的峰面积平均值为（689 875±2561），RSD为0.37%，结果表明精密度较好。

2.1.8 稳定性实验 取上述法舒地尔复乳供试液，分别于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h 按照上述色谱条件测定。法舒地尔峰面积平均值为（7 062 215±41 667），RSD为0.59%，结果表明供试品溶液在8 h 内稳定。

2.1.9 重复性实验 取同批法舒地尔复乳，按供试品溶液制备方法制得6 份平行的供试品溶液，分别进样，记录色谱图。测得的法舒地尔峰面积的RSD为1.18%，表明该方法重复性好。

2.1.10 回收率实验 取6 份空白复乳，每份1.0 g，分别加入法舒地尔溶液（100.06 μg/mL）0.1 mL，涡旋混匀，按照供试品溶液制备方法操作，测定法舒地尔平均回收率为98.02%，RSD为1.31%。

2.1.11 离心保留率 将法舒地尔复乳置于EP管中，用蒸馏水稀释10 倍，室温下，于3000 r/min 低速离心30 min，吸取下清液，按照“2.1.1”利用高效液相法测定药物含量，根据公式离心保留率＝1-W1/W（W1表示离心后未包封于内水相中的药物量，W表示离心后未包封于内水相中的药物量与仍包封于内水相中的药物量之和即药物总量），计算各处方的离心保留率［5］。

2.2 法舒地尔复乳的制备工艺与处方筛选

2.2.1 法舒地尔复乳的基本处方及制备工艺 采用两步乳化法制备法舒地尔复乳。10 g 初乳组成为：以适量蓖麻油为油相，以法舒地尔水溶液为水相（其中含0.1 g 法舒地尔），以1.5 g 的Span 80与Tween 80 的混合物以及0.2 g 的TPGS 为混合乳化剂Ⅰ；复乳的组成为：采用上述制备的10 g 初乳为内相，以8.3 g 水为外水相，以1.5 g 的Tween 80与磷脂的混合物以及0.2 g 的TPGS 为混合乳化剂Ⅱ。在控温下将乳化剂Ⅰ及法舒地尔（0.1 g）溶于水中制备内水相，于磁力搅拌器搅拌（8000 r/min）作用下将内水相缓缓加入油相中（蓖麻油），充分搅拌15 min 得W/O 型初乳。将乳化剂Ⅱ溶解于水中制备外水相，随后在1000 r/min 搅拌条件下，将W/O 型初乳缓缓加入到外水相中，搅拌20 min，得W/O/W 型复乳。

2.2.2 处方筛选 选取初乳中蓖麻油与蒸馏水的质量比（A）、乳化剂I 中Span 80 与Tween 80 的质量比（B）、乳化剂II 中Tween 80 与卵磷脂的质量比（C）为考察因素，以离心保留率为评价指标，每个因素各取3 个水平，采用L9（34）进行正交实验，因素水平见表1，正交试验结果及方差分析结果见表2、表3。

表1 正交因素水平表

表2 L9（34）正交试验及结果

表3 方差分析结果表

根据方差分析结果显示，A、B、C 三个因素中，A、B 对离心保留率有显著影响，且影响顺序为A＞B＞C，正交试验中离心保留率最高的组合为A2B2C3。直观分析结果，由极差R 可以发现对脂质体包封率影响为A＞B＞C，得出最优处方为A2B2C3，与正交分析优选出的条件一致，为正交表中的实验5，即蓖麻油与水质量比为2∶1，乳化剂I 中Span 80 与Tween 80 质量比为7∶3，乳化剂II 中Tween 80 与卵磷脂质量比为4∶1。

2.3 法舒地尔复乳的制备

按照“2.2.2”项下所得最优处方，称取各成分，并按照“2.2.1”项下方法制备法舒地尔的复乳。具体为：在控温下将乳化剂I（1.05 g Span 80、0.45 g Tween 80、0.2 g TPGS）及0.1 g 法舒地尔溶于2.73 g水中制备内水相，于8000 r/min 搅拌作用下将内水相缓缓加入5.47 g 蓖麻油中，充分搅拌15 min 得W/O 型初乳。将乳化剂Ⅱ（1.2 g Tween 80、0.3 g 卵磷脂、0.2 g TPGS）溶解于8.3 g 水中制备外水相，随后在1000 r/min 搅拌条件下，将W/O 型初乳缓缓加入外水相中，搅拌20 min，得W/O/W 型复乳。

2.4 形态观察

取少量复乳涂于载玻片，加少量水稀释，涂匀后加盖玻片，于光学显微镜下观察，结果如图2 所示。由图2 可知，制备的法舒地尔复乳形态圆整、粒度均一。

2.5 粒度测定

图2 法舒地尔复乳显微形态观察

使用马尔文激光粒度仪测定法舒地尔复乳的粒径。仪器的激光束波长设定为633 nm，入射光与散射光束的夹角为90°，测定温度设定为25 ℃。取适量法舒地尔复乳经20 倍量稀释后进行测定，测得复乳的粒径分别为421.5 nm、345.1 nm、380.4 nm，平均粒径为（382.3±38.2）nm。结果见图3。

图3 法舒地尔复乳粒径图

2.6 电导率测定

在室温下，取适量法舒地尔复乳进行电导率的测定，测得复乳的电导率为419 μs/cm、427 μs/cm、437 μs/cm，平均电导率为（428±9.02）μs/cm。

2.7 载药量测定

称3 批法舒地尔复乳，按照“2.1.2”项下操作制备供试品溶液，按照高效液相色谱法进行含量检测，测得法舒地尔复乳的载药量分别为0.41%、0.54%、0.49%，平均载药量为（0.48±0.06）%。

3 讨 论

复乳的稳定性是复乳处方筛选的重要指标，而TPGS 药物的作用除了作为乳化剂，还有提高稳定性的作用，抑制胃肠道药物外排泵P-gp 的作用［6-7］。因TPGS 的价格相对较高，在满足需求的情况下TPGS 的使用量达到最低。TPGS 溶液的制备采用薄膜水化法，称取0.20 g TPGS 置于梨形瓶中，加入10 mL 氯仿溶解，利用旋转蒸发器旋成膜，然后用相应体积的蒸馏水溶解［8-9］。

混合乳化剂比单一乳化剂更能提高复乳稳定性，Span 80 与Tween 80 乳化剂的结合能大大提高复乳的稳定性［10］。复乳制备中，第二步乳化应避免高速或长时间搅拌，否则油膜容易破裂，药物包裹率会变低。