微滴数字PCR检测血清miR-21 和miR-4429在肝癌诊断中的应用

王攀 莫经刚 朱杰 李招云

微滴数字PCR检测血清miR-21 和miR-4429在肝癌诊断中的应用

王攀 莫经刚 朱杰 李招云

目的 应用微滴数字PCR检测血清中miR-21和miR-4429的水平，并探讨联合AFP检测在诊断肝细胞肝癌中的临床价值。方法 收集69例肝癌、47例慢性活动性乙肝以及40例健康体检者血清标本，应用微滴数字PCR检测血清miR-21和miR-4429水平，化学发光法检测血清中AFP水平，并用ROC曲线和Spearman相关进行分析。结果 肝癌组患者miR-21水平明显高于健康对照组和慢性活动性乙肝组（均P＜0.05），miR-4429水平高于健康对照组（P＜0.05）。ROC曲线分析显示：miR-21、miR-4429和AFP 3者联合检测的灵敏度（95.0%）、特异度（92.5%）和准确度（92.7%），较单独检测或两项联合检测有较大提升。miR-21、miR-4429表达与患者年龄、性别、有无HBsAg感染或肝硬化、PLT或AFP水平、TNM分期和疾病状态均无相关性（均P＞0.05）。结论 血清miR-21和miR-4429对肝癌的诊断具有良好的灵敏度和特异度，联合AFP检测可以提高诊断的效能。

微滴数字PCR 肝细胞肝癌 miR-21 miR-4429

肝细胞肝癌是全球常见的恶性肿瘤之一，病毒性肝炎和黄曲霉毒素是目前已知的高危致病因子。在我国，由于乙肝病毒的高感染率导致慢性肝炎、肝硬化的高发，最终导致肝癌的发病率非常高，约占全球肝癌的55%[1]。目前，手术切除是临床常用的治疗手段之一，但是由于缺乏早期有效的诊断措施，大部分患者错过了最佳的手术时期，以致预后较差。因此，如何寻找特异度好、灵敏度高的肝癌肿瘤标志物，是肝癌研究者一直努力的方向。笔者采用微滴数字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）技术检测肝癌患者血清中miR-21和miR-4429水平，并利用化学发光联合检测血清AFP，探讨3者对于诊断肝癌的临床意义，现将结果报道如下。

1 资料和方法

1.1 一般资料 选取温州医科大学附属第一医院2015 年4至9月就诊的50例原发性肝癌患者血清标本，选取台州市中心医院2015年1月至8月就诊的19例原发性肝癌、47例慢性活动性乙肝、40例健康体检者血清标本。其中肝癌组中男51例，女18例，年龄28～83 （58.8±13.7）岁；慢性活动性乙肝组中男31例，女16例，年龄23～76（53.4±12.7）岁；健康体检者中男29例，女11例，年龄21～81（55.7±13.0）岁；3组受检者性别、年龄比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。肝癌组患者均符合中华人民共和国卫生部肝癌诊疗规范（2011年版）的诊断标准，采血前所有患者均未接受化疗、放疗或手术治疗。

1.2 主要仪器和试剂 miRNeasy Serum/Plasma Kit、miRNeasy Serum/Plasma Spike-In Control、miScriptⅡRT Kit、miScript Primer Assay，hsa-miR-21（Cat.no.）、hsa-miR-4429（Cat.no.MS00041377）miScriptSYBR Green PCR Kit试剂盒均购自德国Qiagen公司，ddPCR仪及试剂盒购自美国BioRad公司；i2000全自动化学发光免疫分析仪及配套试剂。

1.3 方法

1.3.1 血清收集 空腹抽取外周静脉血3ml，室温静置1h后，室温下1 000×g离心10min，吸取血清置-80℃保存。

1.3.2 RNA提取 室温下血清溶解后，4℃下16 000×g离心15min。取200μl血清按照miRNeasy Serum/Plasma Kit试剂盒说明书提取RNA，-80℃保存。

1.3.3 逆转录 取2μl模版RNA配成20μl反应体系，按照miScriptⅡRT Kit试剂盒说明书操作，得到的cDNA加200μl无RNA酶水，-20℃保存。

1.3.4 ddPCR 10μl 2X EvaGreen supermix、3.6μl miS-cript Primer Assay、3.6μl miScript Universal Assay、2μl cDNA和0.8μl的去酶水配成20μl PCR反应体系。将20μl反应液和70μl反应油分别加到微滴发生卡上，通过微滴生成器生成微滴，将40μl微滴转移至96孔PCR板上，于PCR仪上进行扩增后，将96孔板放入微滴分析仪，分析每个样品的微滴，最终得出分析数据。PCR反应程序：预变性95℃5min，接着40个循环：变性94℃30s、退火55℃1min，延伸70℃30s，最后4℃5min，90℃5min和4℃保存。

1.3.5 AFP检测 采用i2000全自动化学发光免疫分析仪及配套试剂，按说明书操作。

1.3.6 HBV检测 采用ELISA法分析，按照科华试剂说明书操作。

1.3.7 PLT检测 采用SYSMEX XE-2100血细胞分析仪及配套试剂，按照说明书操作。

1.4 统计学处理 应用SPSS17.0统计软件，计量资料以表示，多组间比较采用方差分析，两两比较时进行方差齐性检验，方差齐时采用LSD法，方差不齐时采用Dunnett T3法；ROC曲线分析检测的灵敏度和特异度；差异表达miRNA与肝癌患者临床病理因素相关性采用Spearman相关分析。

2 结果

2.1 3组受检者血清中miR-21、miR-4429和AFP水平变化的比较 健康对照组血清中miR-21水平最低，慢性活动性乙肝组中miR-21水平居中，与健康对照组比较无统计学意义（P＞0.05）；肝癌组血清中miR-21水平最高，与健康对照组和慢性活动性乙肝组比较差异均有统计学意义（均P＜0.05）。健康对照组血清中miR-4429水平最低，慢性活动性乙肝组中miR-4429水平居中，与健康对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；肝癌组血清中miR-4429水平最高，与健康对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。健康对照组血清中AFP水平最低，慢性活动性乙肝组中AFP水平居中，与健康对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；肝癌组血清中AFP水平最高，与健康对照组和慢性活动性乙肝组比较差异均有统计学意义（均P＜0.05），详见表1。

表1 3组受检者血清中miR-21、miR-4429和AFP水平的比较

2.2 miR-21、miR-4429和AFP单项检测和联合检测在诊断肝癌中的ROC曲线分析 3项联合检测与两项联合检测和单项联合检测比较，可见灵敏度、特异度、准确度和阳性预测值、阴性预测值以及ROC曲线下面积均有明显提高，详见表2。

2.3 血清差异表达miRNA与肝癌患者临床病理因素相关性分析 miRNA-21和miRNA-4429与肝癌患者临床病理因素均无明显相关均（P＞0.05），详见表3。

3 讨论

miRNA是一类长约22nt的小分子非编码RNA，它主要通过与靶基因的3′非翻译区完全或不完全结合，降解靶基因mRNA或者阻止其翻译，从而参与细胞增殖、分化、凋亡、迁移等生物学过程。随着研究的深入，越来越多的证据表明，miRNA与肿瘤发生、发展中的细胞分化成熟障碍、增殖失控、迁移转移等有密切关系[2-3]。有研究表明，来源于肿瘤的miRNA由于避开了内源性核糖核酸酶的活性，在血液中能稳定存在，并且有一定的表达量，可以作为肿瘤标志物使用[4]。

表2 miR-21、miR-4429和AFP在诊断肝癌中的各项指标

表3 肝癌血清差异表达miRNA与临床病理因素相关性分析

目前常用于miRNA分析检测验证的是qPCR，但是检测的过程发现存在极高的差异性，无法作为稳定的检测标准；并且miRNA应用qPCR检测过程中内参的选择也没有标准[5]。因此，有需要寻找新的方法用于血清miRNA检测。研究发现将ddPCR用于miRNA的检测能得到较为理想的效果[6-7]。ddPCR是近年来新推出的一种检测手段。在传统的PCR扩增前对反应液进行微滴化处理，得到20 000个微滴。经PCR扩增后，在微滴分析仪上对每个微滴进行逐个分析，将有荧光信号的微滴为阳性，无荧光信号的微滴为阴性，通过泊松分布原理和阳性微滴的比例计算出靶分子的含量。不受PCR扩增效率的影响，无需制作标准曲线或内参，就能得到绝对定量。Hindson[8]采用ddPCR与qPCR对肿瘤相关miRNA进行方法学比较分析，得出ddPCR对于血清miRNA的检测的灵敏度和特异度均高于qPCR。

本研究通过前期二代测序和筛选的工作，将miR-4429纳入肝癌联合诊断生物标记物，并通过文献检索，联合miR-21[9-10]通过ddPCR对它们进行验证。通过研究发现，肝癌患者血清中miR-21水平升高，与健康对照组和慢性活动性乙肝组比较差异均有统计学意义；肝癌患者血清中miR-4429水平升高，与健康对照组比较差异有统计学意义，且慢性活动性乙肝组与健康对照组比较差异有统计学意义。当miR-21、miR-4429和AFP 3者联合检测时，其灵敏度为95%，特异度为92.5%，准确度为92.9%，较单独检测或两项联合检测有较大幅度的提升，但是与是否HBV感染、TNM分级以及疾病状态等却无明显相关。

目前较为确切研究提示，miRNA中调控肝癌细胞的增值、转移和凋亡的主要有miR-21、miR-26、miR-122。miR-21作为原癌基因，可以通过抑制抑癌基因PTEN，从而加速肝癌细胞生长，增强侵袭和转移的能力[11]，肝癌患者体内miR-21表达量上升提示预后不良，可以作为诊断肝癌潜在的生物标志物[12]。miR-4429在急性缺血性脑卒中[13]、胆道闭锁[14]中有相关报道，而在对于肿瘤细胞的调控途径尚不清楚，需要我们进一步的研究分析。

综上所述，血清miR-21和miR-4429水平在肝癌患者和健康对照组中比较有统计学差异，可以作为潜在的肝癌肿瘤标志物，在临床具有一定应用前景。但是是否可以作为早期癌变的预警指示，还需要加大样品量进一步验证。

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Serum miR-21 and miR-4429 levels detected by droplet digital PCR for diagnosis of hepatocellular carcinoma

WANG Pan，Mo Jinggang，ZHU Jie,et al.Department of Laboratory Medicine,Taizhou Central Hospital,Taizhou 318000,China

Objective To investigate the serum miR-21 and miR-4429 levels detected by droplet digital PCR(ddPCR)in diagnosis of hepatocellular carcinoma(HCC). Methods Serum miR-21 and miR-4429 levels were determined by ddPCR in 69 HCC patients,47 patients with chronic active hepatitis B(CHB)and 40 healthy subjects.Serum AFP levels were measured by chemiluminescence method.ROC curve and Spearman rank correlation were performed data analysis. Results Serum miR-21 levels of HCC group were increased significantly compared with the control group and CHB group(P＜0.05),serum miR-4429 levels increased significantly compared with the normal control group(P＜0.05).ROC curves showed that the sensitivity (95%), specificity(92.5%)and accuracy(92.7%)ofcombination ofmiR-21,miR-4429 and AFP were higher than those ofsingle test or two joint tests.Serum miR-21 and miR-4429 levels were not correlated with age,sex,HBsAg,platelets count,AFP,liver cirrhosis, TNM and disease status(P＞0.05). Conclusion miR-21 and miR-4429 show a good sensitivity and specificity for diagnosis of HCC,and the combination with AFP may further improve the diagnostic efficiency.

ddPCR Hepatocellular carcinoma miR-21 miR-4429

2016-03-22）

（本文编辑：严玮雯）

浙江省医药卫生一般研究计划项目资助（2012KYA183）；台州市市级科技资金项目（121KY09-7）；台州市市级科技资金项目(14SF04)

318000 台州市中心医院检验科（王攀、朱杰、李招云），普外科（莫金刚）

李招云，E-mail:lzy8151@163.com