Semaphorin 5A 在皮肤黑素瘤组织中的表达及与其恶性程度的相关性

谢玉燕，张莉，李凌佳，吴文娟，刘彤云(昆明医科大学第一附属医院,昆明650032)

Semaphorin 5A 在皮肤黑素瘤组织中的表达及与其恶性程度的相关性

谢玉燕，张莉，李凌佳，吴文娟，刘彤云
(昆明医科大学第一附属医院,昆明650032)

目的 观察Semaphorin 5A在皮肤黑素瘤(CMM)组织中的表达情况,并探讨其与CMM恶性程度的相关性。方法 选择20例CMM患者和20例黑素细胞痣者的石蜡包埋组织标本。CMM患者根据Clark(1969)分级方法，Ⅰ级3例(15.00%)、Ⅱ级3例(15.00%)、Ⅲ级4例(20.00%)、Ⅳ级7例(35.00%)、Ⅴ级有3例(15.00%) 。免疫组化法检测Semaphorin 5A在CMM及黑素细胞痣皮损组织中的表达，比较不同病理分级的CMM间Semaphorin 5A表达的差异。结果 Semaphorin 5A在CMM中的阳性表达率(80.00%，16/20)高于黑素细胞痣中的阳性表达率(5.00%，1/20)(P<0.05)；且Semaphorin 5A在CMM中的表达与Clark分级呈正相关(P<0.05)。结论 Semaphorin 5A在CMM组织中的表达升高，与CMM恶性程度有关。

黑素瘤；Semaphorin 5A；免疫组织化学

皮肤黑素瘤(CMM)是一种高度恶性的皮肤肿瘤，其源于黑素细胞，是由外胚层神经嵴产生分化而来。Semaphorin 5A是神经导向分子Semaphorins家族中的一员，该基因已经被证实在胃癌组织中高表达，Semaphorin 5A与plexin B3结合促进胃癌的发展，并影响其侵袭和转移。Woodhouse等[1]在人类黑色素瘤细胞A2058的膜提取物中检测到Semaphorin 5A的表达。而该基因是否在CMM瘤组织中表达及其在瘤细胞中的作用尚未明确。本试验采用免疫组化法检测Semaphorin 5A在CMM瘤组织及黑素细胞痣中的表达，并初步分析Semaphorin 5A表达与CMM恶性程度之间的相关性。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集2009～2015年昆明医科大学第一附属医院皮肤科确诊的20例CMM患者和20例黑素细胞痣者的石蜡包埋组织标本。20例CMM患者中，男8例、女12例，男女比例2∶3。发病年龄32～73岁、平均年龄57.9岁，其中45岁以上者占85%。发生于面部2例(10.00%)、躯干1例(5.00%)、手臂1例(5.00%)、肢端16例(80.00%)。多数患者自述恶变前无明显诱因，患者自述恶变前有明确外伤史3例(15.00%)，曾外用刺激性药物如双氧水、鸡眼膏者1例(5.00%)。皮损多为突出的黑色结节、肿块或在黑色斑疹近期突然增大隆起，色素加深，出现糜烂甚至溃疡，部分患者皮损周围出现黑褐色斑疹呈卫星样分布。其中皮损表现为黑色斑片者5例，斑块者3例，黑色结节者5例，溃疡者7例。Clark(1969)病理分级方法参照文献[2]：根据浸润深度将CMM分为5级：Ⅰ级：瘤细胞限于基底膜以上的表皮内(原位CMM)；Ⅱ级：瘤细胞突破基底膜侵犯到真皮乳头层；Ⅲ级：瘤细胞充满真皮乳头层，并进一步向下侵犯，未到真皮网状层；Ⅳ级：瘤细胞已侵犯到真皮网状层；Ⅴ级：瘤细胞已穿过真皮网状层，侵犯到皮下脂肪层。

1.2 组织中Semaphorin 5A蛋白表达的检测 采用免疫组化法。组织标本均经10%甲醛溶液固定，石蜡包埋，常规制片。将石蜡包埋组织标本制成连续切片，厚度为4～6 μm，然后经二甲苯脱蜡，抗原修复，DAB显色，全部过程严格按照试剂盒说明书进行操作，所用一抗为Semaphorin 5A蛋白多克隆抗体(1∶300)。Semaphorin 5A阳性对照图片为试剂公司提供，并以PBS代替一抗作为阴性对照。

Semaphorin 5A阳性评价标准：阳性表达于细胞质或(和)细胞膜，呈棕黄或黄褐色颗粒。随机选取阳性细胞密度高的区域5 个高倍视野(×400)计数，通过对颜色的强弱及阳性细胞的个数进行评分:没有变色为0分，浅黄色1分，浅褐色2分，褐色3分；阳性细胞数 <5%为0分，5%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分。两项评分相加，并分为4个等级，0～1分为-，2分为+，3～4分++，>5分+++，结果由两名病理科医生采用双盲原则判定。

1.3 统计学方法 采用 SPSS19.0统计软件。计数资料以频次或百分比表示，比较采用χ2检验；Semaphorin 5A与CMM恶性程度等级相关性分析采用Kendall′ tau-c相关性分析法。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CMM组织病理学表现及Clark(1969)分级结果 20例CMM石蜡组织经HE染色，显微镜下可见表皮及真皮分布异形的黑素瘤细胞，沿水平方向和(或)垂直方向生长，侵入真皮及皮下，细胞形态不一，大小不同，有核分裂相出现，部分瘤细胞见明显核仁，并可有色素颗粒沉积。根据Clark(1969)分级方法:Ⅰ级3例(15.00%)，Ⅱ级3例(15.00%)，Ⅲ级4例(20.00%)，Ⅳ级7例(35.00%)，Ⅴ级3例(15.00%) 。临床表现为斑片者Clark分级为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级者3、1、1例，斑块者Clark分级为Ⅱ、Ⅲ级者2、1例，结节者Clark分级为Ⅲ、Ⅳ级者1、4例，溃疡者Clark分级为Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ级者1、3、3例，经过临床及病理学分析发现，临床仅表现为黑斑的CMM多为Ⅰ级或 Ⅱ级，临床为斑块或黑色结节的CMM多为Ⅲ级及Ⅳ级，而出现溃疡的CMM多为Ⅳ级及以上。

2.2 Semaphorin 5A在CMM及黑素细胞痣中的表达比较 Semmaphorin 5A阳性表达主要定位于细胞质和(或)细胞膜，呈棕黄色、褐色。20例CMM中，Semaphorin 5A蛋白表达+++者9例、++者7例、+者3例、阴性者1例，阳性率为80.00%(16/20)。20例黑素细胞痣中，Semaphorin 5A蛋白表达++者 1例、+者 4例、阴性者15例，阳性率5%(1/20)。两者Semaphorin 5A蛋白表达阳性率比较，χ2=23.02，P<0.05。

2.3 Semaphorin 5A在CMM患者中的表达与肿瘤侵袭程度相关性 CMM Ⅰ级患者中Semaphorin 5A表达为-、+、++、+++者分别为1、2、0、0例，Ⅱ级者中分别为0、1、1、1例，Ⅲ级者中分别为0、0、1、3例，Ⅳ级者中分别为0、0、4、3例，Ⅴ级者中分别为0、0、1、2例，Semaphorin 5A在CMM瘤组织中的表达与肿瘤的Clark分级呈正相关(r=0.6，P<0.05)。

3 讨论

CMM是由于黑素细胞过度增生引起的一种高度恶性的皮肤肿瘤，其源于黑素细胞，是由外胚层神经嵴产生分化而来。CMM的发生与免疫、遗传、创伤、环境因素有关，好发于45岁以上中年人及中老年人，青少年发病者甚少，儿童罕见[3]。本研究结果也证实，CMM好发于四肢末端，主要发病人群为45岁以上中老年患者，某些刺激或外伤可能造成黑素细胞痣的恶变，与文献报道基本一致。近年CMM发病率逐年增加。资料显示，全世界CMM在近30年间增长了60%，我国每年约有新发病例2万，其转移速度快，预后差及病死率高，目前已成为恶性程度最高的皮肤肿瘤[3,4]。CMM淋巴转移和血行转移发生早，肿瘤转移患者的治疗效果并不理想，5年生存率只有14%[5]。

CMM的病理表现为表皮及真皮分布异形的黑素瘤细胞，一般为梭形细胞或上皮样细胞等各种细胞形态，侵入真皮及皮下，瘤细胞可见有核分裂相出现，并可有色素颗粒沉积。Clark(1969)分级对CMM的病理浸润深度进行了分级，分级越高，预后越差。本研究结果显示，临床仅表现为黑斑的CMM多为Ⅰ级或Ⅱ级，临床为斑块或黑色结节的CMM多为Ⅲ级及Ⅳ级，而出现溃疡的CMM多为Ⅲ级及以上。

Semaphorins是一个包含了30多个成员的神经轴突导向分子大家族，根据来源、种属与结构的异同，将Semaphorins分为8个亚家族[6]。其中Semaphorin 5是惟一既存在于脊椎动物(Semaphorin 5A和Semaphorin 5B)又存在于无脊椎动物(Semaphorin 5C)中的亚家族[7，8]。Semaphorins家族成员结构上具有一定的相似性，即在N-端含有一个高度保守的、富含半胱氨酸残基的“sema”域，长为400～500个氨基酸[9]。而Semaphorin 5A作为该家族中的一员，其不光含有家族所共有的“Sema”域，并拥有一特征性结构域“TSP-1”，即在胞膜外含有7个Ⅰ型血小板反应素(TSP-1)重复序列， Semaphorin 5A中的“Sema”域和“TSP-1”与肿瘤的发生发展有密切关系[10]。

本试验采用免疫组化方法检测了Semaphorin 5A在CMM瘤组织及黑素细胞痣中的表达情况，结果提示Semmaphorin 5A阳性表达主要定位于细胞质和(或)细胞膜，呈棕黄色、褐色。此结果支持Woodhouse等[1]的实验结果。同时本研究也发现，Semaphorin 5A在CMM瘤组织中高表达，在黑素细胞痣中不表达或弱表达。采用Kendall′ tau-c相关性分析亦发现，Semaphorin 5A在CMM组织中的表达与肿瘤的恶性程度呈正相关，即侵袭深度越深，其表达越强。以上结果提示，Semaphorin 5A可能为CMM恶性程度相关的潜在标志物，并且可能具有促进CMM侵袭转移的能力，但其具体作用机制如何仍有待进一步研究。本试验的局限性在于样本量较小，不排除存在误差的可能。

[1] Woodhouse EC, Fisher A, Bandle RW, et al. Drosophila screening model for metastasis: Semaphorin 5c is required for l(2)gl cancerphenotype[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2003,100(20):11463-11468.

[2] 赵辨.中国临床皮肤病学[M].南京:江苏科学技术出版社,2010:1650.

[3] 郭智俊,黄美云,肖宁新.恶性黑色素瘤86例临床病理分析[J].医学研究杂志,2008,37(9):87-89.

[4] Dzwierzynski WW. Managing malignant melanoma[J].Plast Reconstr Surg， 2013,132(3):446e-460e.

[5] Jemal A, Tiwari RC, Murray T, et al. Cancer Statistics, 2004[J]. CA Cancer J Clin, 2004,54(1):8-29.

[6] Yazdani U, Terman JR.The semaphorins[J]. Genome Biol, 2006,7(3):211.

[7] Guttmann-Raviv N, Kessler O, Shraga-Heled N, et al. The neuropilins and their role in tumorigenesis and tumor progression[J]. Cancer Lett, 2006,231(1):1-11.

[8] Winberg ML, Noordermeer JN, Tamagnone L, et al. Plexin A is a neuronal semaphorin receptor that controls axon guidance[J]. Cell, 1998,95(7):903-916.

[9] Kolodkin AL, Matthes DJ, Goodman CS. The semaphorin genes encode a family of transmembrane and secreted growth cone guidance molecules[J]. Cell, 1993,75(7):1389-1399.

[10] Artigiani S, Conrotto P, Fazzari P, et al.Plexin-B3 is a functional receptor for semaphorin 5A[J]. EMBO Rep, 2004,5(7):710-714.

云南省科技厅-昆明医科大学应用基础研究联合专项(2013FB138)。

刘彤云(E-mail:tongyyun91@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.13.020

R774

B

1002-266X(2017)13-0065-03

2017-01-02)