沙棘水提物对UVC辐射HaCaT细胞损伤的保护作用及其机制

陈晓昱，马文宇(青海大学附属医院，西宁 810001)

沙棘水提物对UVC辐射HaCaT细胞损伤的保护作用及其机制

陈晓昱，马文宇
(青海大学附属医院，西宁 810001)

目的 探讨沙棘水提物对短波紫外线(UVC)辐射人角质形成细胞(HaCaT细胞)损伤的保护作用及其机制。方法 体外培养HaCaT细胞株，将其随机分成对照组、UVC模型组、沙棘水提物2 mg/mL组、沙棘水提物20 mg/mL组。对照组不加药，不进行UVC照射；UVC模型组去盖置于UVC消毒灯管(30 W，辐射距离70 cm)下进行照射，辐射剂量为20 J/m2，照射30 min；沙棘水提物组分别加入2 、20 mg/mL沙棘水提物5 min后，进行UVC照射，辐射剂量及时间同上。辐射后用PBS洗2遍，换完全培养基继续培养24 h。 观察各组细胞的形态及数量变化，酶标法测定细胞中的超氧化物歧化酶(SOD)活力、过氧化氢酶(CAT)活力及细胞培养上清液中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活力,细胞中丙二醛(MDA)含量。结果 对照组细胞形态良好，细胞呈上皮细胞样贴壁生长，细胞呈圆梭形，彼此之间伸出伪足连接，细胞核清晰可见。UVC模型组可见大量细胞碎片，大量细胞凋亡，细胞形态模糊不清，活细胞数明显减少。各沙棘水提物组细胞损伤程度减轻，随着沙棘水提物浓度的升高细胞形态逐渐趋于正常，且凋亡细胞数量逐渐减少，存活细胞数目逐渐增多。与对照组比较，其余各组活细胞数减少(P均<0.05)；与UVC模型组比较，沙棘水提物2 mg/mL组、沙棘水提物20 mg/mL组活细胞数增加(P均<0.05)。与对照组比较，除沙棘水提物20 mg/mL组细胞SOD活力差异无统计学意义外，其余组细胞中SOD、CAT活力及细胞培养上清液中GSH-PX活力均降低，MDA含量升高。与UVC模型组比较，沙棘水提物2 mg/mL、20 mg/mL组细胞中SOD、CAT活力，细胞培养上清液中GSH-PX活力升高，细胞中MDA含量降低(P均<0.05 )。结论 沙棘水提物对UVC照射HaCaT细胞造成的损伤具有保护作用，其机制可能与其抗氧化作用及增强细胞生存活力有关。

细胞损伤；短波紫外线;人角质形成细胞;沙棘水提物；氧化应激损伤

自然环境中的紫外线按照波长减小和能量增加的顺序分为三个波段：长波紫外线(UVA，320～400 nm)、中波紫外线(UVB，290～320 nm)和短波紫外线(UVC，200～290 nm)。过量紫外线辐射可导致电光性眼炎、光老化(皮肤干燥、松弛、皱纹形成等)和癌症等疾病。在三个波段中，因UVC经过大气层时多数被臭氧层吸收，虽然其具有比UVA和UVB更高的能量和生物杀伤能力，亦常被国内外学者所忽略。目前，UVC独具的生物杀菌功能已被广泛应用在日常生活中，如饮用水、食品包装材料的杀菌，实验室、学校、医院等场所室内常规消毒等方面，车间工人、医生等特殊人群不可避免地受到UVC伤害。沙棘是一种能够在极端环境(生长环境温度为-40～40 ℃)下生存的沙棘属固氮落叶灌木[1]，含有黄酮类、维生素类、氨基酸类、多酚类、糖类、超氧化物歧化酶(SOD)及各种微量元素等200多种有效成分，并已证实沙棘具有抗氧化、抗肿瘤、降血脂、抗动脉粥样硬化和抑菌、免疫调节及放射防护功能[2～6]。2015年10月～2017年1月，本研究采用体外培养人角质形成细胞(HaCaT细胞)，参照抗氧化功能评价方法，利用UVC辐射HaCaT细胞，探讨沙棘水提物是否对UVC有防护作用，为未来保健食品、药品、防护化妆品的开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 20∶1沙棘水提物(西安瑞林生物科技有限公司)，HaCaT细胞株(南京凯基生物科技发展有限公司)，0.25%胰酶、DMEM培养基、胎牛血清均购自美国GIBCO公司，SOD试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)试剂盒、过氧化氢酶试剂盒、丙二醛(MDA)试剂盒均购自南京建成生物研究所。BB150二氧化碳培养箱(美国Thermo公司)、KA-1000C低速台式离心机(上海安亭科学仪器厂)、SIGMA 3K15离心机(SIGMA公司)、OLYMPUS-DP 72倒置显微镜(OLYMPU公司)、AxioCam ICc 5倒置显微镜(ZEISS公司)、xMark酶标仪(BIO-RAD公司)、infinite M200PRO酶标仪(TECAN公司)、DU800分光光度计(BECKMAN COULTER公司)、W201B水浴锅(金坛市岸头科辉仪器厂)、高级石英紫外线杀菌灯管(北京精英特种灯泡厂)等。

1.2 HaCaT细胞培养、分组及处理 根据文献[7]将原代HaCaT细胞接种于内含10% FBS、10 U/mL青霉素和10 U/mL链霉素的DMEM完全培养基中，后将其置于37 ℃、5% CO2饱和湿度的培养箱中进行常规培养。取处于对数生长期的3～4代细胞进行实验。当培养瓶中细胞融合至90%时，进行胰酶消化，离心、计数，以每孔5×105个细胞均匀接种于六孔板中，将其随机分成对照组、UVC模型组、沙棘水提物2 mg/mL组、沙棘水提物20 mg/mL组。对照组不加药物，不进行UVC照射；UVC模型组去盖置于UVC消毒灯管(30 W，辐射距离70 cm)下进行照射，辐射剂量为20 J/m2，照射30 min；沙棘水提物组分别加入2、20 mg/mL沙棘水提物5 min后，进行UVC照射，辐射剂量及时间同上。辐射后用PBS洗2遍，换完全培养基继续培养24 h。

1.3 各组细胞形态及数量变化 使用AxioCam ICc 5倒置显微镜观察×4、×10、×20、×40倍数镜下细胞形态及数量的变化，照相。并细数×20镜下细胞数，实验重复6次。

1.4 细胞中SOD、CAT活力，培养上清液中GSH-PX活力，细胞MDA含量测定 采用酶标法。吸取各组六孔板中上清液、留存(GSH-PX实验待用)，PBS洗2遍，胰酶消化细胞2～3 min，加完全培养基终止消化，微量移液器轻轻吹打，离心(1 000 r/min，10 min)，弃上清，留沉淀细胞，再加入PBS 1 mL 轻轻吹打、离心(1 000 r/min，10 min)2遍，往各组沉淀细胞中加入适量缓冲液(每106个细胞中加入生理盐水0.3～0.5 mL)，冰水浴下电动匀浆仪研磨3 min后待用。使用酶标仪检测OD值。采用说明书中公式计算各指标含量。

2 结果

2.1 各组细胞形态及数量变化 对照组细胞形态良好，呈上皮细胞样贴壁生长，呈圆梭形，彼此之间伸出伪足连接，细胞核清晰可见。UVC模型组可见大量细胞碎片，大量细胞脱壁、变圆、皱缩，细胞形态模糊不清，呈凋亡态，部分存活细胞正常结构消失，细胞核肿胀，活细胞数明显减少。沙棘水提物2 mg/mL、20 mg/mL组与UVC模型组相比较，细胞碎片及脱壁细胞数量大量减少，细胞形态有所恢复，存活细胞膜完整，细胞肿胀程度减轻，活细胞数量有不同程度的增多。沙棘水提物20 mg/mL与2 mg/mL组相比较，细胞形态已趋于正常，细胞脱壁现象少见，活细胞数目明显增多。沙棘水提物20 mg/mL组细胞形态基本正常，与对照组相比较无明显差异，细胞碎片及脱壁现象极少。对照组、UVC模型组、沙棘水提物2 mg/mL组、沙棘水提物20 mg/mL组活细胞数分别为(1 180.17±47.72)、(92.00±11.56)、(371.33±19.8)、(811.17±16.87)个/20倍视野。与对照组比较，其余各组活细胞数减少(P均<0.05) ；与UVC模型组比较，沙棘水提物2 mg/mL组、沙棘水提物20 mg/mL组活细胞数增加(P均<0.05)。

2.2 各组细胞中SOD、CAT活力，细胞培养上清液中GSH-PX活力及细胞MDA含量比较 见表1。

表1 各组细胞中SOD、CAT活力，细胞培养上清液中GSH-PX活力及细胞MDA含量比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与UVC模型组比较，#P<0.05。

3 讨论

酶类抗氧化系统(包括SOD、CAT、GSH-PX等抗氧化酶)和非酶类抗氧化系统(包括黄铜类、维生素C、维生素E、类胡萝卜素、转铁蛋白、植物多糖、甾醇、酚类化合物、硒、铜、锌等成分)是机体抗氧化系统的重要组成部分。正常生物体内过氧化物质和抗氧化物质存在动态平衡，而大量紫外线辐射会导致活性氧自由(ROS)过表达，超过自身抗氧化酶系的降解能力，进而使细胞发生氧化应激反应而损伤细胞[8，9]。暴露于UVC中的细胞能够产生比暴露于UVA、UVB下的细胞更多的ROS和超氧化物[10]。MDA是组织细胞被ROS损伤后形成的脂质过氧化物[11]，能够与磷脂酰乙醇胺和蛋白质交联，破坏细胞膜结构，导致细胞死亡，其含量能间接反映体内ROS的产生情况和机体组织细胞发生过氧化损伤程度，是机体衰老的重要指标。SOD、GSH-PX、CAT等抗氧化酶能够对抗MDA等过氧化物对细胞产生的氧化损伤，间接反映了机体细胞清除ROS的能力。

沙棘含有多种有效活性成分，在我国被作为藏药、蒙药和中药，已有悠久的用药历史，远在8世纪末藏学典籍《四部医典》已有记载，1997年并被《中国药典》收录，近年受到国内外专家学者的广泛关注。胡芳等[12]试验表明沙棘果渣醇提物可显著提高小鼠血清、肝脏和脑组织中SOD、CAT、GSH-PX活力和总抗氧化能力，并明显降低了组织细胞中的MDA含量。焦岩等[13]试验证实，沙棘总黄酮(沙棘主要活性成分)能够有效清除超氧阴离子、羟基自由基、DPPH自由基、ABTS自由基等氧自由基。Hwang等[14，15]试验证实，UVB辐射小鼠皮肤细胞后，沙棘提取物显著提高了细胞中的SOD活力和含水量。本研究结果显示，UVC模型组大量HaCaT细胞凋亡，细胞碎片及脱片现象严重，提示造模成功；沙棘水提物组的存活细胞形态明显优于UVC模型组，凋亡细胞数目明显减少，其中沙棘水提物20 mg/mL组细胞形态基本正常，且数量上与对照组差异无统计学意义。提示沙棘水提物具有抑制细胞凋亡的作用。此外，沙棘水提物组HaCaT细胞中SOD、GSH-PX、CAT活力明显上升，MDA含量明显下降。提示沙棘水提物具有抗氧化能力。

综上所述，沙棘具有抑制细胞凋亡的作用，对UVC照射HaCaT细胞造成的氧化应激损伤具有一定的保护能力，其机制可能与它的抗氧化作用及增强细胞生存活力有关。本实验对沙棘水提物抑制细胞凋亡的具体机制及能否促进细胞增殖未进行探讨，尚需进一步研究。

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青海省(应用)基础研究计划项目(2016-ZJ-792)。

马文宇(E-mail:mawenyu730126@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.13.012

R392.2

A

1002-266X(2017)13-0042-03

2017-01-12)