不同浓度白色念珠菌连续培养对比观察*

叶合敏，李帅，向洋，付豪，杜永洪

（重庆医科大学生物医学工程学院/省部共建国家重点实验室培育基地/重庆市超声医学工程重点实验室，重庆400016）

不同浓度白色念珠菌连续培养对比观察*

叶合敏，李帅，向洋，付豪，杜永洪△

（重庆医科大学生物医学工程学院/省部共建国家重点实验室培育基地/重庆市超声医学工程重点实验室，重庆400016）

目的通过对比观察白色念珠菌（白念珠菌）在LB营养琼脂培养平板上不同浓度的生长情况，探讨白念珠菌平板稀释法计数的适宜观察浓度。方法将白念珠菌原液稀释至约1.5×109cfu/mL，编号为A。然后取7个20 mL的无菌试管，每个试管加入9 mL无菌生理盐水，分别编号为B～H。从A试管中吸取1 mL菌液至B管，混匀后再吸取1 mL至C管，如此连续倍比稀释至H管。用移液枪吸取100 μL不同浓度的白念珠菌悬液到对应编号的一次性琼脂培养平板，用接种环涂抹均匀，置于37℃孵箱内培养。结果培养48 h后，浓度数量级为104的白念珠菌较浓度数量级为102、103菌体密集且体积小，而105较104更密集、体积更小，呈针尖状，肉眼不易观察具体形态。白念珠菌浓度数量级为102、103时，真菌数量为20～300个，可以计数，而浓度数量级达104及以上时，则不能计数。分别培养24、48、72 h后取出琼脂培养平板观察，培养24 h后肉眼可观察到菌落，但具体形态不明显；培养48 h后较24 h时体积大，大致形态可看出，呈乳白色圆形或卵圆形，表面光滑湿润，有光泽，直径为1.0～2.0 mm；培养72 h后较培养48 h后体积稍大，但呈现黄色。结论

菌液浓度为1.5×102cfu/mL时可以作为平板稀释法的适宜计数浓度，培养48 h后为菌落形态观察的最佳时机。

白念珠菌；集落计数，微生物；体外研究；培养基；琼脂

白色念珠菌（白念珠菌）因各种原因引起的机体免疫力下降或菌群失调时，可引起假丝酵母菌病。白念珠菌为最常见的真菌致病菌[1]，致病机制尚未明确，初步认为白念珠菌致病力与其黏附能力、形态转变、产生有毒性的多种酶、产生抑制免疫活性细胞趋化作用的代谢产物有关[2]。目前，对白念珠菌引起的相关疾病主要通过药物治疗，但存在毒性反应大、治疗周期长、易产生耐药性等缺点[3]。通过对白念珠菌的培养，可了解其生长周期与基本特性，为确定白念珠菌在营养琼脂培养平板上培养的最适观察时间及其平板稀释法最理想计数浓度提供条件，也为体外研究治疗白念珠菌疾病的新方法提供支持。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1实验设备HD-650-u超净工作台（苏净集团苏州安泰空气技术有限公司，规格650mm×680 mm×625mm）、HZ-9211K恒温振荡器（江苏省太仓市科教器材厂）。

1.1.2实验材料白念珠菌菌株购自上海宝录生物科技有限公司，LB肉汤、LB营养琼脂、0.9%氯化钠（NaCl）溶液、一次性培养平板（直径9 cm）、10 mL刻度吸管、1.5 mL EP管、接种环。

1.2方法

1.2.1琼脂培养平板的制备参照LB营养琼脂配制方法，按40 g/L将粉末状LB营养琼脂在烧瓶中进行溶解，充分混匀消毒[4]后，液体处于60～70℃时在超净台上取13 mL于一次性培养平板中，静置凝固后琼脂厚度3～4 mm，密封保存于4℃冰箱中待用[5]。

1.2.2白念珠菌原菌液制备按25 g/L将粉末状LB肉汤在烧瓶中进行溶解，充分混匀消毒冷却至室温。在超净工作台上，用接种环挑取琼脂培养平板中培养48 h的最大白念珠菌1～2个接种于液体培养基中[6]，调节恒温摇床振荡器在150 r/min、37℃条件下摇菌13～15 h。

1.2.3制备不同浓度的菌液在超净工作台上，用移液枪吸取1 mL白念珠菌菌液，无菌生理盐水稀释，用比浊法对比菌液浓度，制备成原菌液浓度约为1.5×109cfu/mL，并编号为A。然后取7个20 mL的无菌试管，分别编号为B、C、D、E、F、G、H，再分别加入9 mL无菌生理盐水。（1）用刻度吸管从A试管中取1 mL白念珠菌原菌液，加入B试管，混匀，B试管菌液稀释浓度约为10倍（比浊法得菌液浓度约为1.5×108cfu/mL）；（2）用刻度吸管从B试管中取1 mL白念珠菌菌液，加入C试管，混匀，C试管的菌液稀释浓度约为102倍（菌液浓度约为1.5× 107cfu/mL）；（3）重复该操作至H试管，H试管的菌液稀释浓度约为107倍（菌液浓度约为1.5×102cfu/mL）。以上菌液浓度约为1.5×108、1.5×107、1.5×106、1.5×105、1.5× 104、1.5×103、1.5×102cfu/mL的白念珠菌菌液配置完毕。

1.2.4白念珠菌平板接种在超净工作台上，用移液枪吸取100 μL不同浓度的白念珠菌悬液到对应编号的一次性营养琼脂培养平板，用接种环涂抹均匀，置于37℃孵箱内培养。

2　结果

2.1不同浓度数量级的白念珠菌培养48 h后的生长情况培养48 h后，浓度数量级为102的白念珠菌的生长情况为：单个生长，未形成菌落，呈圆形或卵圆形，表面光滑，菌体较大，直径为1.0～2.0 mm，见图1a；浓度数量级为103的白念珠菌的生长情况为：多数为单个生长，少部分形成大小疏密不一的菌落，菌体直径为1.0～2.0 mm，见图1b；浓度数量级为104、105的白念珠菌的生长情况为：广泛形成大片菌落，见图1c、d。图1c较图1a和图1b菌体密集且体积小，直径为0.3～1.0 mm；图1d较图1c更密集、体积更小，呈针尖状，肉眼不易观察具体形态。

2.2不同浓度数量级的白念珠菌培养48 h后计数结果浓度数量级在102、103时，真菌数量在20～300个，可以计数；而菌液浓度数量级在104及以上时不能计数，所以菌液浓度为1.5×102cfu/mL时可以作为平板稀释法最理想的计数浓度。见表1。

图1　不同浓度数量级的白念珠菌培养48 h后的生长情况

表1　不同浓度数量级的白念珠菌培养48 h后计数结果

2.3培养24、48、72 h后浓度数量级为103的白念珠菌生长情况白念珠菌在LB营养琼脂培养平板上培养24 h后即可在肉眼下观察到菌落，但仅是一个个针尖大小的圆形小点，具体形态不明显，见图2a；培养48 h后体积较培养24 h后大，大致形态可看出，呈乳白色圆形或卵圆形，表面光滑湿润，有光泽，直径为1.0～2.0 mm，见图2b；培养72 h后体积较培养48 h后稍大，直径为1.5～2.5 mm，但呈现黄色，可能与培养时间过长有关，见图2c。

图2　培养24、48、72 h后浓度数量级为103的白念珠菌生长情况

3　讨论

白念珠菌属于酵母属真菌[7]，白念珠菌有其独特的双相（酵母相和菌丝相）生长方式[8]，真菌类鉴别培养一般采用的培养平板为沙氏培养平板。在平常的临床工作中LB营养琼脂培养平板培养白念珠菌较常用，该培养平板价格较便宜，配制简单，适合真菌生长[9]。

本实验图1a～d表明，高浓度的白念珠菌在营养琼脂培养平板上形成的菌落数量较多、形态偏小、呈点状或丝状，难以计数；低浓度的白念珠菌，在营养琼脂培养平板上形成肉眼清晰可见的单个菌落，数量偏少，可以计数。

本实验表明，浓度数量级在102、103时，真菌数量在20～300个时，可以计数；而菌液浓度数量级在104及以上时不能计数，所以菌液浓度为1.5×102cfu/mL时可以作为平板稀释法最理想的计数浓度。

本实验中，作者观察到影响白念珠菌培养结果的因素有：在制备培养平板及培养白念珠菌时，要严格无菌操作，避免杂菌污染[10]；在培养期间注意按时观察平板菌株生长状况，做好记录。如相机拍照，要标明时间、刻度；72 h后由于培养时间过长会有部分菌落偏黄，从而影响菌落色泽的判断；白念珠菌稀释浓度不同时菌体大小会出现不同，可能与各菌体营养成分不足或分布不均有关。

为了直接观察微生物的形态及生长情况，将微生物培养在固体培养平板表面上进行形态观察和菌落计数，已经被公认为比较精准的实验方法。掌握白念珠菌体外培养的基本方法对于了解白念珠菌的生长周期有一定作用，对后期实验中寻找最适接种时期、筛选菌液浓度与药物浓度的比例有较大帮助。本实验中所用的菌落平板稀释法的熟练操作可为开展超声联合药物对白念珠菌的损伤作用及研究超声对其细胞壁的破坏作用的实验研究提供支持。

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Comparative observation of continuous culture with different concentrations of Candida albicans*

Ye Hemin，Li Shuai，Xiang Yang，Fu Hao，Du Yonghong△
（School of Biomedical Engineering，Chongqing Medical University/Province-Ministry Co-Build State Key Lab Cultivation Base/Chongqing Key Laboratory of Ultrasound in Medicine Engineering，Chongqing 400016，China）

Objective To investigate the suitable observation concentration in the count of Candida albicans plate dilution method by comparatively observing the growth situation in different concentrations of Candida albicans in LB nutrient agar culture plate.Methods The Candida albicans stock solution was diluted to about 1.5×109cfu/mL with No.A.Then 7 sterile tubes with 20 mL were taken，each tube was added with 9 mL sterile normal saline with No.B-H.One mL of bacterial solution was absorbed from the tube A to the tube B，after mixing，1 mL of bacterial solution was absorbed again to the tube C，so did successive multiple proportion dilution to the tube H.100 μL of different concentrations of Candida albicans suspension was absorbed by pipette to the one-off agar plate with corresponding number，which was evenly coated with the inoculating loop and cultured at 37℃incubator.Results After 48 h culture，Candida albicans with the order of magnitude 104had smaller thallus with smaller volume than the order of magnitude 102，103，while 105was even more denser and smaller volume than 104，which was needle-shaped，its actual morphology was not easier to be observed by naked eye.When the orders of magnitude of Candida albicans was 102，103，the fungal counting was 20-300 and could be counted，whereas the concentration orders of magnitude reached more than 104，which could not be counted.After 24，48，72 h culture，the agar culture plate was taken out for observing.The colony could be visually observed after 24 h culture，but the actual form was not obvious.After culturing for 48 h，the volume was large than that after culturing for 24 h culture，rough morphology could be seen，milky white round or oval，smooth surface and moist，shiny，diameter of 1.0-2.0 mm.The volume after 72 h culture was slightly larger than that after 48 h culture，but the bacterial color was yellow.Conclusion The bacterial solution concentration of 1.5×102cfu/mL can be used as the suitable counting concentration of plate dilution method，culturing for 48 h is the best time to observe the colony morphology.

Candida albicans；Colony count，Microbial；In vitro；Culture media；Agar

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.21.005

A

1009-5519（2016）21-3272-03

重庆市基础科学与前沿技术研究专项资助项目（csct2016jcyjA0098）；重庆医科大学2015年国家自然科学基金预研资助项目（NSFYY201528）。

叶合敏（1994-），在读本科生，主要从事生物医学工程（医疗器械方向）方面的学习。

△，E-mail：duyonghong@yeah.net。

（2016-05-22）