全肝CT灌注成像评估兔肝VX2瘤有效灌注及与不成对动脉的相关性*

刘智俊，龙学颖，刘慧，廖华之

（1.南华大学附属第一医院放射科，湖南衡阳421001；2.中南大学湘雅医院放射科，湖南长沙410008）

全肝CT灌注成像评估兔肝VX2瘤有效灌注及与不成对动脉的相关性*

刘智俊1，龙学颖2△，刘慧2，廖华之1

（1.南华大学附属第一医院放射科，湖南衡阳421001；2.中南大学湘雅医院放射科，湖南长沙410008）

目的分析兔VX2肝肿瘤模型的全肝CT灌注成像灌注参数与不成对动脉（UAs）的相关性，为探讨肿瘤血管生成状况及与灌注成像表现的本质联系提供依据。方法采用健康清洁级新西兰大白兔55只，其中假手术对照组5只，剔除经解剖和病理证实为未成功手术成瘤的，最终实验组动物为42只。术后2周获得兔VX2肝肿瘤边缘、瘤周肝及假手术组的肝脏灌注血流量（BF）、肝脏灌注血容量（BV）、肝动脉灌注量（ALP）、门静脉灌注量（PVP）、肝动脉灌注指数（HPI）等参数值，并于检查后通过免疫组织化学染色获得肿瘤标本的UAs值。结果实验组VX2瘤边缘BF、BV、ALP、PVP、HPI与实验组瘤周肝比较，差异均有统计学意义（P<0.05）；实验组瘤周肝各灌注成像参数值与假手术对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。BF、BV、ALP、HPI与UAs呈正相关（r=0.475、0.434、0.635、0.323，P＜0.05或0.01），PVP与UAs呈负相关（r=-0.365，P＜0.05）。其中以ALP与UAs的相关系数最高（r=0.635，P<0.01）。结论全肝CT灌注可定量评估兔肝VX2瘤的肝动脉和门静脉灌注信息，并可在一定程度上反映肿瘤血管生成状况。

肝肿瘤，实验性；动脉；免疫组织化学；体层摄影术，X线计算机；血液灌注；新生血管化，病理性；兔

肿瘤血管生成是肿瘤发生发展的标志和关键进程[1]。因此，准确评价肿瘤的血管生成与肿瘤微循环状况是进行肿瘤评估的重要内容。而肝肿瘤血管生成的主要来源为肿瘤自身的新生血管生成和肝窦的毛细血管化[2]。目前以CT灌注成像为代表的全脏器容积灌注成像可无创伤性定量评估肿瘤的微循环状况，其潜在意义不仅可以辅助判断血管成熟度及预测抗血管生成疗效，而且有望帮助联合治疗策略的选择及监测靶向治疗疗效。但目前探讨灌注参数与肿瘤血管成熟度有关的研究不多。故本实验拟采用兔VX2肝肿瘤模型研究全肝CT灌注成像与肿瘤血管生成之间的本质联系，对于探讨肝肿瘤血管生成的基础及CT灌注成像在体评估价值有一定的作用，也将为今后肝肿瘤血管生成的在体影像学评估提供依据。

1　材料与方法

1.1实验动物采用健康清洁级新西兰大白兔55只，体质量（2.50±0.25）kg，由中南大学湘雅三医院动物实验中心提供。随机选5只作为假手术对照组，剔除经解剖和病理证实为未成功手术成瘤的，最终实验组动物为42只。

1.2方法

1.2.1实验组动物建模采用开腹法[3]制作兔肝VX2瘤动物模型并对已行手术的实验兔双侧耳朵内侧进行逐一编号。

1.2.2双源CT检查于术后2周对已建模的实验组兔及假手术对照组兔全身麻醉后，行全肝CT灌注成像[西门子双源64层螺旋CT（somatom definition syngo CT 2010A），配置有相应后处理工作站syngo mulimodality workplace]。先扫出定位图像，同时调整好对比剂用量为1 mL/kg，生理盐水为5 mL，对比剂注射采用美国双筒高压注射器（mallinckrodt optivantage TM），注射速率为1 mL/s（对比剂注射方法参考相关文献[4]进行选择）。确保扫描野包含整个肝脏（膈顶至肝下缘）后，团注对比剂并采用双源螺旋CT容积摇篮床式扫描方法，即无缝连续动态往复扫描模式，扫描参数为：延迟时间6 s后机器开始扫描，总扫描时间为61 s，球管每周旋转时间0.33 s，管电压80 kV，管电流50mAs，探测器宽度48mm，螺距1.0mm；图像重建层厚为1.5mm，层间距为1.5 mm，重建矩阵为512×512，卷积核值为B30f。每次双源螺旋CT扫描灌注成像共计生成完整原始数据30组，每组31幅图像，将其全部输入西门子双源螺旋CT后处理工作站中。

1.2.3图像后处理根据CT应用中的VPCT Body灌注软件中的肝脏灌注应用模块，然后结合文献[5-6]的报道及软件操作说明，将腹主动脉定义为输入动脉，门静脉定义为输入静脉，按步骤计算得出肝脏灌注血流量（BF）、肝脏灌注血容量（BV）、肝动脉灌注量（ALP）、门静脉灌注量（PVP）、肝动脉灌注指数（HPI）等双源螺旋CT灌注彩色数据图像。在增强动脉期上肿瘤实质达强化峰值时选取肿瘤周边较明显强化的区域，在其区域内定义感兴趣区（ROI）[4]，以避开肿瘤坏死区及周围邻近正常肝组织，并测量3次相同大小的ROI，通过计算机自动计算得出三组灌注参数值并取其平均值，以减少取样误差；瘤周肝区域的ROI为CT增强及灌注上尚未出现明显的形态学改变，并病理证实无转移[5]，ROI大小同前，同样测量3次，并得出三组灌注参数值，然后取其平均值；最后以肿瘤边缘区及相应瘤周肝的各灌注参数平均值作为结果记录。somatom definition syngo CT 2010A的VPCT Body灌注软件对各参数的计算方法采用的是斜率法[6]。

1.2.4定量不成对动脉（UAs）肿瘤的ROI选择将参考标本剖面所见情况，并在周边明显强化的区域选取“热点”，以避开中心坏死区，用来评估肿瘤的新生血管。VX2肿瘤内新生细动脉，即UAs，定义为肿瘤实质内α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）染色阳性的血管，且不伴有明显的纤维组织或门静脉及胆管，并且满足α-SMA染色阳性的膜厚度与最小的管腔外径的比值大于1/10，以排除静脉。具体方法参照文献[7-8]进行，先在低倍镜（40×）下观察整个切片，寻找肿瘤内新生血管最多处，即“热点”，然后在高倍镜（200×）下计数，记录5个视野内UAs的总数。

1.3统计学处理应用SPSS19.0统计软件对所有数据进行分析处理，数值变量数据均以±s表示。兔肝VX2瘤边缘与肿瘤周边肝组织的CT灌注参数值之间的差异采用两配对样本t检验，实验组肿瘤周肝与假手术对照组肝灌注参数的差异采用两样本t检验；VX2肿瘤的全肝CT灌注各参数值与UAs的相关性采用Pearson积差相关系数相关法来分析[9]。以假设检验水准α=0.05（双侧），所有统计结果均以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1免疫组织化学法检测结果42只荷瘤兔肿瘤的UAs为（47.05±7.51）个，见图1a～b。

图1　α-SMA染色结果（200×）

表1　兔肝VX2瘤边缘、瘤周肝及假手术对照组全肝CT灌注参数比较（±s）

表1　兔肝VX2瘤边缘、瘤周肝及假手术对照组全肝CT灌注参数比较（±s）

注：实验组瘤边缘为兔肝VX2肿瘤周边的参数值，实验组瘤周肝为瘤周肝组织的参数值，假手术对照组肝为未种植肿瘤的假手术相应部位正常肝组织的参数值。与实验组瘤周肝比较，aP＜0.05；与假手术对照组比较，bP<0.05，cP>0.05。

组别BF [mL/（100 mL·min）] n BV（mL/100 mL）ALP [mL/（100 mL·min）] PVP [mL/（100 mL·min）] HPI（%）实验组瘤边缘实验组瘤周肝假手术对照组42 42 5 243.98±73.43ab206.92±74.07c204.54±2.74 24.36±7.43ab20.67±7.71c19.62±2.03 65.43±9.46ab42.43±7.77c40.43±1.45 14.43±2.31ab121.95±9.53c119.39±5.39 81.97±3.12ab15.66±0.29c25.30±0.37

2.2VX2瘤边缘、瘤周肝及假手术对照组全肝CT灌注成像参数值比较实验组VX2瘤边缘BF、BV、ALP、PVP、HPI与实验组瘤周肝及假手术对照组比较，差异均有统计学意义（P<0.05）；实验组瘤周肝各灌注成像参数值与假手术对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表1、图2a～f。

图2　VX2瘤动脉期增强图及灌注彩图

2.3VX2瘤边缘全肝CT灌注成像定量参数值与UAs的相关性BF、BV、ALP、HPI与UAs呈正相关（r=0.475、0.434、0.635、0.323，P＜0.05或0.01），PVP与UAs呈负相关（r=-0.365，P＜0.05）。其中以ALP与UAs的相关系数最高（r=0.635，P<0.01）。见表2。

表2　VX2瘤边缘全肝CT灌注成像参数值与UAs相关性

3　讨论

VX2瘤兔肝接种成瘤因建模简便易行、成功率高、周期短、肿瘤生长增殖活跃、肿瘤血管生成丰富，成为原位肝肿瘤研究的常用肿瘤模型之一[5，10]。在应用该模型上，一部分研究因该模型肝肿瘤对比增强影像学上增强早期强化明显而类似肝细胞癌（HCC），认为其为富血供肝肿瘤[1，4]，而另有学者因该肿瘤在稳定成瘤后的典型强化方式为环形强化而类似肝转移瘤，推测其为乏血供肿瘤[11]。存在的这种分歧提示，对兔肝VX2瘤影像学上发现的血供特点仍然需要从肿瘤血管生成的层面进行更深入的分析。本实验研究结果表明，瘤周肝组织与假手术对照组肝组织各灌注参数差异无明显统计学意义，提示开腹假种瘤手术本身并未对背景肝脏的灌注状态产生显著影响，肿瘤区域的血流动力学应主要归因于肿瘤所致。实验组肿瘤边缘的灌注参数与瘤周肝、假手术对照组比较，差异均有统计学意义（P<0.05），表明边缘有活力的肿瘤区域的相关血流动力学发生了显著变化。本实验研究结果与其他类似研究的结果相符，其中，肿瘤边缘的BF、BV增高的主要原因可能是由于肿瘤新生血管的形成，使肿瘤边缘区域的血管数量较周边正常肝组织增加；此外，肿瘤血管形态不同于正常的肝组织血管，肿瘤血管通常粗细不均并有较多异常分支，其内皮细胞基底膜不完整致肿瘤血管渗透性增加等。上述原因造成大量对比剂进入肿瘤内，从而导致肿瘤的BF和BV增加[12]。而肿瘤边缘PVP较瘤周肝及假手术对照组显著降低，ALP、HPI较明显高于瘤周肝及假手术对照组，其主要原因可能是在肿瘤内的动脉与门脉之间的血供比例发生了改变，肿瘤生长压迫肝窦致使门静脉压力增高，继而使肿瘤的PVP减少；而与此同时，肿瘤可能通过肝窦的毛细血管化[13]来增加肿瘤的ALP，以代偿PVP减少的部分。因此，CT灌注成像结果提示，兔肝VX2瘤仍然主要是从动脉获得相应的血供而不是门静脉，其血供明显高于邻近肝组织，为一富血供肿瘤，从这一点看，兔肝VX2瘤与临床上HCC血供特点有相似之处[14]。但这种血供基础需要进一步从病理与免疫组织化学水平进行探讨。

肝脏的组织结构相对较为特殊，除肝动脉外，也有门静脉、胆管、肝静脉及其各级分支等管道存在，其中在正常肝组织内肝动脉、门静脉、胆管呈伴行关系，而肝静脉则不伴行。故学者们引入UAs的概念，排除静脉，以更好地评价肝肿瘤的血供特点[7，15]。对HCC的临床研究[7]表明，在CT三期增强扫描上，UAs与动脉期肿瘤的强化程度呈明显正相关；而HCC的对比剂增强超声造影临床研究[14]也发现UAs与多种超声灌注参数值，包括最大强度值（IMAX）、上升时间（RT）、达峰值时间（TTP）、平均通过时间（mTT）、上升斜率（RS）、廓清时间（WT）均有相关性。本实验得到的VX2瘤CT灌注成像定量参数与UAs的相关性分析结果表明，UAs与BF、BV、ALP、HPI均呈正相关性，其中以与ALP的相关系数最高，而与PVP呈弱负相关。因此，研究结果提示，全肝CT灌注参数BF、BV、ALP、HPI可在一定程度上反映UAs量的多少。而经免疫组织化学检查证实，本实验发现兔VX2肝肿瘤内有丰富的UAs，BF、BV、ALP、HPI与UAs呈正相关，可以推测肿瘤内有功能的新生细血管仍然是其动脉血供增加的重要病理基础之一，这与Himeno等[15]报道肝癌内的新生肿瘤细动脉有可能是肝癌血管造影的具有显著动脉血供的病理基础相似。尽管α-SMA染色阳性的UAs计数主要反映血管的成熟度，但这种新生细血管毕竟不同于正常血管，仍然可能未完全被周细胞覆盖，其内皮细胞基底膜不完整，从而使血管的渗透性增加；此外，血管直径粗细不一，并有较多的异常分支、吻合支及动静脉瘘形成也可能是重要原因之一。UAs另一重要作用在于其排除了门静脉血流的影响，故UAs与PVP呈负相关，更从免疫组织化学水平说明了兔VX2肝肿瘤供血主要是肝动脉供血而非门静脉。

综上表明，兔肝VX2瘤的肿瘤血管生成复杂，全肝CT灌注参数可定量评估兔肝VX2瘤的肝动脉和门静脉灌注信息，并可在一定程度上反映其肿瘤血管生成状况。

[1]ZhangLJ，Wu S，WangM，etal.Quantitativedual energy CT measurements in rabbit VX2 liver tumors：comparison to perfusion CT measurements and histopathological findings[J].Eur J Radiol，2012，81（8）：1766-1775.

[2]Ippolito D，Capraro C，Casiraghi A，et al.Quantitative assessment of tumour associated neovascularisation in patients with liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma：role of dynamic-CT perfusion imaging[J].Eur Radiol，2012，22（4）：803-811.

[3]李辉，姜春霞，武明辉，等.兔VX2肝癌模型的建立及MRI表现[J].医药论坛杂志，2014，35（11）：15-17.

[4]Jiang HJ，Zhang ZR，Shen BZ，et al.Quantification of angiogenesis by CT perfusion imaging in liver tumor of rabbit[J].Hepatobiliary Pancreat Dis Int，2009，8（2）：168-173.

[5]Jiang HJ，Lu HB，Zhang ZR，et al.Experimental study on angiogenesis in a rabbit VX2 early liver tumour by perfusion computed tomography[J].J Int Med Res，2010，38（3）：929-939.

[6]Fink C，Brix G，Halliburton SS，et al.Functional computed tomography imaging[J].Invest Radiol，2012，47（1）：1.

[7]Kim CK，Lim JH，Park CK，et al.Neoangiogenesis and sinusoidal capillarization in hepatocellular carcinoma：correlation between dynamic CT and density of tumor microvessels[J].Radiology，2005，237（2）：529-534.

[8]裴小青，刘隆忠，左菲菲，等．肝细胞癌的超声造影定量参数与肿瘤内新生动脉的相关性研究[J]．中华超声影像学杂志，2011，20（3）：222-225．

[9]Sato M，Nakai Y，Nakata W，et al.Microvessel area of immature vessels is a prognostic factor in renal cell carcinoma[J].Int J Urol，2014，21（2）：130-134.

[10]Tam AL，Melancon MP，Abdelsalam M，et al.Imaging intratumoral nanoparticle uptake after combining nanoembolization with various ablative therapies in hepatic VX2 rabbit tumors[J].J Biomed Nanotechnol，2016，12（2）：296-307.

[11]Jia HS，Quan XY，Zeng S，et al.Dynamic evaluation of rabbit VX2 hepatic carcinoma with CT and MRI[J].Di Yi Jun Yi Da Xue Xue Bao，2002，22（2）：141-144.

[12]David G，Ciurea AV，Iencean SM，et al.Angiogenesis in the degeneration of the lumbar intervertebral disc[J].J Med Life，2010，3（2）：154-161.

[13]Tsushima Y，Blomley JK，Kusano S，et al.The portal component of hepatic perfusion measured by dynamic CT：an indicator of hepatic parenchymaldamag[J].Dig Dis Sci，1999，44（8）：1632-1638.

[14]熊义富，张小明，杨林，等.肝细胞肝癌多层螺旋CT征象与肿瘤血管生成相关性的研究[J].中国CT和MRI杂志，2015，13（11）：50-53.

[15]Himeno H，Enzan H，Saibara T，et al.Hitherto unrecognized arterioles within hepatocellular carcinoma[J].J Pathol，1994，174（3）：217-222.

Total liver CT perfusion imaging for assessing correlation between rabbit liver VX2 tumor effective perfusion and unpaired arteries*

Liu Zhijun1，Long Xueying2△，Liu Hui2，Liao Huazhi1
（1.Department of Radiology，First Affiliated Hospital，University of South China，Hengyang，Hunan 421001，China；2.Department of Radiology，Xiangya Hospital，Central South University，Changsha，Hunan 410008，China）

Objective To analyze the correlation between the parameters of total liver CT perfusion imaging in rabbit VX2 liver tumor model and unpaired arteries（UAs）to provide a basis for the intrinsic contact between the tumor angiogenesis status and perfusion imaging manifestations.Methods Fifty-five healthy clean class New Zealand while rabbits were adopted.A-mong them，5 cases were in the sham operation control group，those were removed due to un-succeeded operative tumor formation verified by anatomy and pathology，and 42 cases were finally the experimental animals.The parameters of blood flow（BF），blood volume（BV），arterial liver perfusion（ALP），portal liver perfusion（PVP）and hepatic perfusion index（HPI）of the tumor rim，surrounding liver tissue and sham-operated group were obtained at postoperative 2 weeks.After the examination，the UAs values of tumor specimens were obtained by immunohistochemical staining.Results BF，BV，ALP，PVP and HPI had statistically significant differences between the tumor rim and the paracancerous liver tissue（P<0.05），but which had no statistically significant difference between the paracancerous liver tissues in the experimental group and the sham operation group（P>0.05）.BF，BV，ALP and HPI had positive correlation with UAs（r=0.475，0.434，0.635，0.323，P<0.05 or 0.01），PVP had negative correlation with UAs（r=-0.365，P<0.05）.Among them，ALP had the highest correlation coefficient with UAs（r=0.635，P<0.01）.Conclusion Total liver CT perfusion can quantitatively evaluate the liver artery and portal vein perfusion information of the rabbit liver VX2 tumor，and can reflect the status of tumor angiogenesis to some extent.

Liver neoplasms，experimental；Arteries；Immunohistochemistry；Tomography，X-ray computed；Hemoperfusion；Neovascularization，pathologic；Rabbit

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.21.002

A

1009-5519（2016）21-3263-04

国家自然科学基金资助项目（30800266）。

刘智俊（1986-），硕士研究生，主要从事腹部疾病影像诊断的相关研究。

△，E-mail：280413177@qq.com。

（2016-08-11）