高透明度琼脂的制备工艺研究

1234*倪 辉1234朱艳冰1234肖安风1234李清彪1234

(1.集美大学食品与生物工程学院,福建厦门 361021;2.福建省食品微生物与酶工程重点实验室,福建厦门 361021;3.厦门市食品生物工程技术研究中心,福建厦门 361021;4.厦门南方海洋中心海藻资源化深加工利用利用重点实验室,福建厦门 361021)

琼脂又名琼胶,是从江蓠等红藻中提取出来的一种多糖[1],是目前世界上用途最广泛的海藻胶之一[2]。琼脂是以多糖的形式存在于红藻细胞壁的细胞间隙中,可加热水提取并脱水制备而得[3]。经对琼脂的组成结构进行系统研究之后,发现琼脂是由琼脂糖和琼脂胶两部分组成[4],其中具有凝胶作用的是琼脂糖,而琼脂胶没有凝胶作用。目前,琼脂广泛应用于食品、生化医药及农业领域中。在食品行业中,琼脂主要用于制作果冻、酸奶、软糖、冰激凌和蛋黄酱稳定剂、面包膨松剂,以及增加饮料食品粘度、赋予粘滑口感、或作为食品包装材料等作用[5-6]。在生物医药领域,琼脂主要应用在凝胶电泳、色谱分离、细胞培养、细菌检验等方面[7]。

透明度是琼脂产品的重要品质指标,其对微生物菌落观察的准确性具有重要影响,并且是决定饮料和果冻产品透明度的关键因素。虽然人们对琼脂的结构进行了深入研究,但对琼脂透明度的影响因素及控制透明度的技术尚未充分研究。目前,人们常采用增强琼脂亲水性的方式来增加其透明度,如烷基化法、羧烷基化法和缩水甘油醚改性法等。烷基化法与羧烷基化法只有在特定位置的C上取代的衍生物才有效增强其亲水性。在缩水甘油醚改性法中,琼脂分子支链性质不同会直接影响改性后的亲疏水性[8]。这些弊端导致琼脂产品的透明度不稳定,影响了果冻等食品的品质及微生物菌落观察的稳定性。目前,国外已经生产制备了质量稳定的高透明度琼脂,但国内尚未研究该类技术,导致相关产品大量依赖进口[9-10]。

基于以上研究现状,本论文通过对各类琼脂的质量指标进行对比分析,确定高透明度琼脂的质量指标;在此基础上,采用在羧甲基化法进行实验,因为这种方法作为C2羧烷基,其取代反应是随即进行的,不会改变琼脂基本骨架结构,是最有效的引入亲水基团的改性方法[11]。但羧甲基化法在提高透明度的同时,会使琼脂的凝胶强度下降明显,所以实验以普通国产琼脂为原料,将透明度和凝胶强度同时作为质量指标,对制备高透明度琼脂工艺进行研究,以开发达到或超过国外同类产品透明度质量指标并且保持高凝胶强度的琼脂产品,为高透明度琼脂的国产化提供技术依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

国产琼脂(包括琼脂17090201、琼脂BD18062702、琼脂BD18041704、琼脂18040302、琼脂LX18020701、琼脂JKW18020703、琼脂JKW18030201、琼脂GF8017121805、琼脂GF8018020803、琼脂BD18040302等) 福建绿麒食品有限公司;NaBH4、无水Na2SO4国药集团化学试剂有限公司;进口琼脂A1296、A6606 Sigma有限公司;氯乙酸 成都艾科达化学试剂有限公司;NaOH、冰醋酸、乙醇、95%酒精 西陇化工股份有限公司。

FE20K型酸度计 瑞士梅特勒-托利多公司;BS233S 型电子天平 北京德国赛多利科学仪器有限公司;MS-H-Pro+型加热磁力搅拌器 北京大龙兴创实验仪器有限公司;7200型分光光度计 上海尤尼柯仪器有限公司;WSB-2白度仪 上海昕锐仪器有限公司;WNB22型数显恒温水浴锅 上海美墨尔特贸易有限公司;ZXRD-B5210烘箱 上海智城分析仪器制造有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 国产琼脂和进口高透明度琼脂的品质指标 对比分析琼脂BD18062702、琼脂BD18041704、琼脂18040302、琼脂Sigma A6066、琼脂Sigma A1296的凝胶强度、透明度、浊度和白度,找出透明度最高的琼脂产品及其品质参数,并分析其他琼脂与高透明度琼脂的品质差异。

1.2.2 高透明度的琼脂制备工艺 将25 g琼脂17090201(凝胶强度1188.0 g/cm2、透明度89.2%),37.5 g无水Na2SO4、4.3 g NaBH4和14 g NaOH分散于200 mL水中,50 ℃搅拌20 min;再加入200 mL质量分数为10%的NaOH溶液,搅拌45 min;加入适量氯乙酸,在适当的温度下搅拌反应一定时间后抽滤去除反应液,滤渣用1000 mL水搅拌清洗4次至pH为7.0～8.5,再次分散在1000 mL水中,并用冰醋酸调节pH,搅拌30 min,抽滤去除水后用1000 mL乙醇浸泡30 min,抽滤去除乙醇,65 ℃干燥120 min,粉碎过80目筛备用。

1.2.3 琼脂及氯乙酸加入方式对琼脂凝胶强度和透明度的影响 试验两种琼脂加入的工艺:(a)先溶解试剂再加入琼脂粉的工艺:将无水Na2SO4、NaBH4、和NaOH溶解后,再加入琼脂粉。(b)先加入琼脂粉再溶解其他试剂:将琼脂粉与无水Na2SO4分散在水中后,再加入NaBH4和NaOH。

对比两种氯乙酸加入的工艺:工艺Ⅰ:将0.36 g/g氯乙酸溶于10 mL水中,每隔5 min分四次等量加入,每次加入0.25 mL。工艺Ⅱ:将0.36 g/g氯乙酸溶于10 mL水中,每隔10 min分两次等量加入,每次加入5 mL。

浮游动物样品采集，数量及生物量计算均参照《淡水浮游生物调查技术规范》执行[3]。各常规理化因子包括氨氮（NH3-N）、水温（WT）和透明度（SD）、高锰酸盐指数（CODMn）、总磷（TP）、总氮（TN）、叶绿素 a（Chla）、溶解氧（DO）测定均参照《水和废水监测分析方法》(第四版)进行检测。

按照1.2.2的工艺分别采用上述琼脂及氯乙酸加入方式,进行交叉组合,在50 ℃反应50 min,用冰醋酸调节pH=6.0后清洗干燥,制备得到反应后的四种样品。样品A采用工艺Ⅱ(b);样品B采用工艺Ⅰ(b);样品C采用工艺Ⅱ(a);样品D采用工艺Ⅰ(a)。测定各样品的琼脂凝胶强度和透明度。

1.2.4 反应温度对琼脂透明度和凝胶强度的影响 将无水Na2SO4和NaOH等试剂溶解后,再加入琼脂17090201,并取0.38 g/g氯乙酸溶于10 mL的水中,分成两份间隔10 min添加进入反应体系。按照1.2.2的工艺分别在40、45、50、55 ℃的条件下反应50 min,用冰醋酸调节pH=6.0后清洗干燥,制备得到反应后的样品,测定各样品的琼脂凝胶强度和透明度。研究反应温度对琼脂凝胶强度和透明度的影响。

1.2.5 氯乙酸添加量对琼脂透明度和凝胶强度的影响 将无水Na2SO4和NaOH等试剂溶解后,再加入琼脂17090201,并分别取0.34、0.36、0.38、0.40 g/g 氯乙酸溶于10 mL的水中,分成两份间隔10 min添加进入反应体系。按照1.2.2的工艺。在50 ℃反应50 min,用冰醋酸调节pH=6.0后清洗干燥,制备得到反应后的样品,测定各样品的琼脂凝胶强度和透明度。研究氯乙酸添加量对琼脂凝胶强度和透明度的影响。

1.2.6 反应时间对琼脂透明度和凝胶强度的影响 将无水Na2SO4和NaOH等试剂溶解后,再加入琼脂17090201,并取0.38 g/g氯乙酸溶于10 mL的水中,分成两份间隔10 min添加进入反应体系。按照1.2.2的工艺在50 ℃的条件下,分别反应20、35、50、65 min,用冰醋酸调节pH=6.0后清洗干燥,制备得到反应后的样品,测定各样品的琼脂凝胶强度和透明度。研究反应温度对琼脂凝胶强度和透明度的影响。

表1 国产琼脂和进口高透明度琼脂的质量对比Table 1 Comparison of the qualities of domestic agars and imported high-transparent agars

注:同列不同小写字母表示差异显著差异(P<0.05);表2同。1.2.7 清洗pH对琼脂透明度和凝胶强度的影响 将无水Na2SO4和NaOH等试剂溶解后,再加入琼脂17090201,并取0.38 g/g氯乙酸溶于10 mL的水中,分成两份间隔10 min添加进入反应体系。按照1.2.2的工艺在50 ℃的条件下反应50 min,用冰醋酸分别将体系pH调到4.0、5.0、6.0、7.0。然后清洗干燥,制备得到反应后的样品,测定各样品的琼脂凝胶强度和透明度。研究不同pH对琼脂凝胶强度和透明度的影响。

1.2.8 不同原料琼脂对高透明度琼脂凝胶强度、透明的和浊度的影响 分别取25 g不同批次的原料琼脂(琼脂LX18020701、琼脂JKW18020702和琼脂JKW18030201),在氯乙酸添加为0.38 g/g(间隔时间10 min分两次添加)的情况下,50 ℃反应50 min,用冰醋酸调节pH=5.0后清洗干燥,制备得到反应后的样品,测定各样品的凝胶强度、透明度与浊度。

1.2.9 指标测定

1.2.9.1 透明度的测定 称取1.5 g琼脂倒入500 mL的烧杯内,加入100 mL水,加热至沸腾使琼脂完全溶解,补足加热损失的水份,冷却至85 ℃,倒入比色皿中,用蒸馏水调零,在750 nm下测定透明度(T)。

1.2.9.2 凝胶强度的测定 称取1.5 g琼脂样品,置于500 mL的烧杯中,加入100 mL水,加热至沸腾使琼脂完全溶解,补足加热损失的水份,倒入培养皿中,冷却凝固后用保鲜膜包裹防止水分流失,室温冷却12 h,采用水压法测定凝胶强度[12]。

1.2.9.3 白度的测定 将琼脂样品过80目筛,用白度仪测定白度。

1.2.9.4 浊度的测定 称取1.5 g琼脂样品,置于500 mL的烧杯中,加入100 mL水,加热至沸腾使琼脂完全溶解,补足加热损失的水份,冷却至85 ℃,倒入测试瓶中至刻度线位置,用浊度仪测定浊度[13]。

1.3 数据处理

实验采用3次平行实验,平均值为实验数据。采用WPS软件进行平均值、标准偏差和相对标准偏差的计算,用 SPSS Statistics 20.0(IBM)软件进行显著性分析(P<0.05)。

2 结果与讨论

2.1 国产琼脂和进口高透明度琼脂的品质指标分析

由表1可知,通过对不同琼脂产品质量进行分析,发现国产琼脂(琼脂BD18062702、琼脂BD18041704、琼脂18040302)透明度小于90%,凝胶强度在1100～1500 g/cm2之间,浊度在50 NTU以上,白度均小于55%。两种Sigma高透明度琼脂的透明度显著高于(P<0.05)国产琼脂,浊度和凝胶强度显著低于(P<0.05)国产琼脂;其中高透明琼脂SigmaA1296透明度为94.4%,浊度为17 NTU,白度为66.74%,凝胶强度为685.2 g/cm2;高透明度琼脂SigmaA6066的透明度为92.3%,浊度为21.1 NTU,白度为65.61%,凝胶强度为801.5 g/cm2。通过对比发现,进口高透明度琼脂的透明度、浊度、白度和凝胶强度分别达到92%、21 NTU、66%、801.5 g/cm2左右,为满足实际生产需要,国产高透明琼脂至少需满足上述指标。

表1的结果同时表明,琼脂产品的浊度和白度与透明度变化趋势相同,凝胶强度则与透明度变化相反。相关研究表明,当琼脂中含有较多亲水基团时,琼脂分子可结合更多的水分子,其形成双螺旋结构趋势减弱,而伸展分散的趋势增加,因此,对光折射减弱,透明度变高,凝胶强度变低[10]。因此,在琼脂分子中引入亲水基团是提高琼脂透明度的主要方法途径。

2.2 琼脂及氯乙酸加入方式对琼脂凝胶强度和透明度的影响

根据琼脂加入反应体系的时间及氯乙酸加入模式(速度)不同进行羧甲基化反应,共制备得到4种样品(表2);它们的凝胶强度没有显著差异,但透明度差异显著(P<0.05),其中D样品(先溶解试剂、再加入琼脂粉,氯乙酸等分两次添加)透明度最高。

表2 琼脂及氯乙酸加入方式对透明度与凝胶强度的影响Table 2 The effect of agar and chloroacetic acid addition on the transparency and gel strength

在羧甲基化反应过程中,无水Na2SO4主要作为多糖溶解的抑制剂。琼脂加入反应体系的时间对其溶胀性有显著影响,从而会影响琼脂与氯乙酸的反应速度。氯乙酸是羧甲基化的反应试剂,加入过快,琼脂内外反应不均匀,加入过慢,会被碱中和而失去反应效率,氯乙酸加入速度是影响氯乙酸反应效率的重要因素。

在氯乙酸添加工艺相同的条件下,先配反应溶液后加入琼脂的制备样品(样品D)透明度显著高于(P<0.05)先加入琼脂后配反应溶液制备得到的样品(样品A)。这是由于样品琼脂与无水Na2SO4混合后,再加入水配制反应溶液将导致无水Na2SO4在琼脂表面形成水合硫酸钠[14],使琼脂颗粒与氯乙酸分子隔离,导致反应不均匀或阻断了反应的进行。在琼脂加入时间相同的情况下,样品D的透明度大于样品C,说明将氯乙酸等分成两次添加相比于等分成4次添加的反应效率跟高;其原因可能是将氯乙酸分成4次添加,在反应体系中浓度低,容易被碱中和至有效反应浓度值以下[11],导致反应速度慢。

通过以上试验,确定琼脂羧甲基化反应配料的工艺为:将无水Na2SO4和NaOH等试剂溶解后,再加入琼脂粉,并将反应用的氯乙酸等分成两份间隔10 min添加进入反应体系。

2.3 反应温度对琼脂透明度和凝胶强度的影响

反应温度是影响琼脂羧甲基化速度的重要因素[14],因此会影响羧甲基反应后琼脂的透明度。从图1中可以看出,随着反应温度不断上升,琼脂透明度逐步增加,凝胶强度不断降低。这是因为反应温度的升高使分子运动加剧,增加了氯乙酸分子与琼脂分子有效碰撞几率,增加羧甲基化反应速率[15]。此外,在高温下进行羧甲基化将导致过渡羧甲基化,最终使琼脂失去凝胶性[16-17]。图1显示,当反应温度大于50 ℃后,虽然羧甲基化后琼脂透明度还不断上升,但凝胶强度降至有效凝胶强度值(800 g/cm2)以下,故综合考虑,采用50 ℃的反应温度。

图1 反应温度对琼脂凝胶强度、透明度的影响Fig.1 Effects of reaction temperatureon gel strength and transparency

2.4 氯乙酸添加量对琼脂透明度和凝胶强度的影响

如图2所示,随氯乙酸用量不断增加,琼脂胶强度逐渐下降,而透明度则逐渐升高。这是由于氯乙酸用量增加使羧甲基程度不断增高,在琼脂分子骨架上引入了更多的亲水基团,从而导致琼脂凝胶强度下降、透明度升高[18]。当氯乙酸添加量为 0.38 g/g 时,反应后琼脂透明度为96.8%,凝胶强度为861.3 g/cm2;氯乙酸添加量为 0.40 g/g时,反应后琼脂的透明度为 96.7%,凝胶强度为648.2 g/cm2,低于有效凝胶强度值。因此,选择氯乙酸添加量为 0.38 g/g。

图2 氯乙酸添加量对凝胶强度和透明度的影响Fig.2 The effect of chloroacetic acid contenton the gel strength and transparency

2.5 反应时间对琼脂透明度和凝胶强度的影响

相关研究表明,反应时间对羧甲基化反应具有重要影响,反应时间短时,氯乙酸无法与琼脂分子充分反应,导致羧甲基化反应不能彻底进行[19]。如图3所示,当反应时间由20 min逐渐增加到50 min时,透明度呈上升趋势。当反应时间达到50 min时,琼脂透明度达到最高,凝胶强度为842.4 g/cm2。但随着反应时间增加到65 min时,琼脂透明度和凝胶强度同时呈现下降的趋势,这主要是副反应及羧甲基化反应过度。因此,选取反应时间为50 min。

2.6 清洗体系pH对琼脂透明度和凝胶强度的影响

pH对琼脂性质影响很大,它可以直接影响着琼脂的凝胶强度[20]。如图4所示,当清洗溶液pH=5时凝胶强度与透明度达到了最大值,当pH<5时,琼脂的凝胶强度出现了大幅度下降,这与刘汶甲等[21]的研究结果一致,因为pH能够影响琼脂分子间氢键的形成和琼脂分子中的盐桥状态[22]。当pH>5时,琼脂的凝胶强度也随pH升高而降低,因为随着pH上升,增加了带负电子硫酸酯基团的斥力,这一结果与Norziah等[23]在研究卡拉胶和琼脂混合凝胶的质构特性中所得的结论相似。因此,在清洗后用冰醋酸将体系pH调整为5.0。

表3 高透明度琼脂制备工艺稳定性试验结果Table 3 The repeatability of process for preparation high transparency agar

图3 反应时间对凝胶强度和透明度的影响Fig.3 The effect of reaction timeon gel strength and transparency

图4 pH对凝胶强度和透明度的影响Fig.4 The effect of pH on gel strength and transparency

2.7 不同批次原料琼脂对高透明度琼脂凝胶强度、透明的和浊度的影响

对三个不同批次的琼脂原料进行高透明度琼脂制备实验,氯乙酸添加量0.38 g/g,反应温度为50 ℃,反应时间为50 min,清洗后调节pH=5.0后干燥粉碎,各样品品质测定结果如表3所示,计算后得到三个不同批次的样品其凝胶强度均值为1095.2 g/cm2,相对标准偏差为1.8%;透明度均值为96.5%,相对标准偏差为0.6%;浊度均值为8.9 NTU,相对标准偏差为1.1%。以上结果说明优化的工艺制备得到高透明度琼脂相关指标具有良好的稳定性且与进口高透明度琼脂指标一致。

3 结论

国产琼脂与进口高透明度琼脂产品的主要质量差异是:国产琼脂的透明度与白度低,浊度高;采用羧甲基化工艺提高琼脂透明度,优化的工艺条件为:氯乙酸添加量0.38 g/g,反应温度50 ℃,反应时间50 min,调节pH=5.0后清洗干燥。用此工艺制备高透明度琼脂,透明度为96.5%±0.6%,凝胶强度为(1095.2±19.8) g/cm2,浊度为(8.9±0.1) NTU,结果稳定,且指标优于进口高透明琼脂。因此,本项目建立了稳定生产高透明度琼脂的工艺,为提高国产琼脂的价值提供了技术参考。