紫外分光光度法测定川射干须根中总黄酮的含量*

罗森，袁崇均，陈帅，王笳

（四川省中医药科学院，成都610041）

紫外分光光度法测定川射干须根中总黄酮的含量*

罗森，袁崇均，陈帅，王笳

（四川省中医药科学院，成都610041）

目的建立川射干须根中总黄酮含量测定的方法。方法采用紫外分光光度法测定川射干须根中的总黄酮含量，以射干苷为对照品，测定波长为266 nm。结果射干苷在0.824 4～9.068 4 μg/mL时与吸光度呈良好的线性关系（r=0.999 8）；平均回收率为100.45%，相对标准偏差为1.15%；川射干须根中总黄酮的平均含量为1.03%。结论紫外分光光度法操作简便、灵敏、准确，具有良好的重复性和较高的回收率，可作为川射干须根的总黄酮含量测定方法。

分光光度法，紫外线；黄酮；根茎；异黄酮类；川射干

川射干为鸢尾科植物鸢尾（Iris Tectorum Maxim.）的干燥根茎，具有清热解毒、祛痰、利咽的功效，用于热毒痰火郁结、咽喉肿痛、痰涎壅盛、咳嗽气喘[1]，主产于四川、重庆、贵州、云南、广西等[2-3]，文献报道川射干植物中含有丰富的化合物种类，包括黄酮类、三萜类、酚类及醌类等[4-6]，其总黄酮提取物有很强的药理作用[7-11]，《中华人民共和国药典》规定川射干在采收时须去除须根。然而一种植物的不同部位一般具有相似的化学成分，在川射干须根中作者也发现其含有丰富的总黄酮成分[12-14]，并且通过对本院培育的川射干新品系（CSG1-9）的研究发现，栽培的川射干中须根重量占比很大，最高可达21.93%[15]。为提高川射干全株植物的资源利用率，作者以射干苷为对照品，对川射干须根的总黄酮含量进行了测定。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1药物川射干须根由本院中药种植与资源所夏燕莉副研究员提供，采自川射干培育基地（四川省成都市双流县），经鉴定为鸢尾科鸢尾属植物鸢尾（Iris Tectorum Maxim.）的须根，对照品射干苷（自制，批号：20130701，含量大于99%）。

1.1.2仪器与试剂UV-2401PC型紫外分光光度计（日本岛津），CPA225D型电子天平（德国赛多利斯），KQ-500E型超声波清洗器（昆山市超声波仪器有限公司）。乙醇为分析纯，水为纯化水。

1.2方法

1.2.1溶液的配制

1.2.1.1供试品溶液的制备采挖川射干，剪下须根，洗净、剪碎、烘干，粉碎成细粉（过40目筛），精密称取1.0 g，置于具塞三角瓶中，加入50 mL 70%乙醇，称定质量，超声30 min，取出，称定质量，补足减失的质量，混匀，过滤，取续滤液，摇匀，得供试品溶液，备用。

1.2.1.2对照品溶液的制备精密称取105℃干燥至恒重的射干苷对照品10 mg于50 mL容量瓶中，加适量70%乙醇，超声溶解，并定容至刻度，摇匀，备用。

1.2.2测定波长的选择取对照品、供试品溶液各1.0mL，分别置于50 mL容量瓶中，加70%乙醇定容至刻度，摇匀，作为测试溶液。以70%乙醇为空白，分别将上述2种测试溶液在200～400nm时进行扫描，得到吸收曲线，供试品与对照品的吸收曲线形状基本一致，在266 nm处有最大吸收峰。因此选择266 nm为测定波长。

1.2.3方法学验证

1.2.3.1标准曲线的建立分别精密吸取射干苷对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2 mL于50 mL容量瓶中，加70%乙醇定容至刻度，摇匀，在266 nm波长处以70%乙醇为空白，分别测定吸光度。以射干苷对照品溶液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程。

1.2.3.2精密度试验取对照品溶液1.0 mL，置于50 mL容量瓶中，加70%乙醇定容至刻度，摇匀。以70%乙醇为空白，按紫外分光光度法，在266 nm波长处测定吸光度，重复测定6次。测得的吸光度值无明显变化，计算相对标准偏差（RSD）。

1.2.3.3稳定性试验取供试品溶液1.0mL，置于50 mL容量瓶中，加70%乙醇定容至刻度，摇匀。以70%乙醇为空白，按紫外分光光度法，在266 nm波长处测定吸光度，于0、1、2、3、4、5、6 h进行测定。计算RSD。

1.2.3.4重现性试验取6份供试品溶液及1份对照品溶液。精密吸取对照品、供试品溶液各1.0mL，分别置于50 mL容量瓶中，加70%乙醇定容至刻度，摇匀。以70%乙醇为空白，按紫外分光光度法，在266 nm波长处测定吸光度，并计算总黄酮含量。

1.2.3.5加样回收率试验取已知总黄酮含量（1.08%）的川射干须根细粉约500 mg，共6份，精密称定，精密加入适量的对照品，分别置于6个具塞三角瓶中，加入50 mL 70%乙醇，称定质量，超声30 min，取出，称定质量，补足减失的质量，混匀，过滤，取续滤液，摇匀，得6份供试品溶液。另取1.2.1.2项下对照品溶液。精密吸取对照品、供试品溶液各1.0 mL，分别置于50 mL容量瓶中，加70%乙醇定容至刻度，摇匀。以70%乙醇为空白，按紫外分光光度法，在266 nm波长处测定吸光度，并计算总黄酮含量及加样回收率。

1.2.4含量测定取5份1.2.1.1项下供试品溶液，另取1.2.1.2项下对照品溶液，精密吸取对照品、供试品溶液各1.0 mL，分别置于50 mL容量瓶中，加70%乙醇定容至刻度，摇匀。以70%乙醇为空白，按紫外分光光度法，在266 nm波长处测定吸光度，并计算总黄酮含量。

2　结果

2.1线性范围线性回归方程为Y=0.109 9X-0.017，r= 0.9998（n=11），结果表明，射干苷在0.8244～9.0684μg/mL时呈良好的线性关系。

2.2精密度试验RSD为0.79%。

2.3稳定性试验RSD为0.97%，表明供试品溶液在6 h内稳定。

2.4重现性试验样品中总黄酮含量为1.05%，RSD为1.42%（n=6），表明该方法重现性良好。

2.5加样回收率试验样品平均回收率为100.45%，RSD为1.15%，见表1。

2.6含量测定5份样品中总黄酮平均含量为1.03%，见表2。

表1　加样回收率试验结果（n=6）

表2　川射干须根中总黄酮含量测定结果

3　讨论

3.1供试品中总黄酮的提取川射干须根中含多种异黄酮类化合物，异黄酮类化合物的提取在试验前期分别采用不同浓度（30%、50%、70%、100%）的乙醇及甲醇作为提取溶媒，考察川射干须根中总黄酮含量，作者对比了超声处理30 min和热回流提取1 h 2种处理方法。通过波长扫描和含量测定，结果显示，在70%乙醇为溶媒，超声30 min条件下，所测得样品中总黄酮含量最高。在对超声时间的选择上，分别选择10、20、30、40、50、60 min进行比较，结果发现超声30 min样品含量达到最高，后续时间延长无显著差异，故选用超声提取30 min。

3.2测定方法的确定黄酮成分的分析测定方法主要包括薄层扫描法、高效液相色谱（HPLC）法、紫外分光光度法等。薄层扫描法在测定川射干须根中总黄酮含量时影响因素较多，测定结果波动大。另外，由于川射干须根中总黄酮成分种类较多，通过HPLC法测定每种黄酮成分的含量再加和来测定总黄酮的含量也并不现实。川射干须根中黄酮类化合物的紫外区间的吸光度值虽不一致，但基本都在代表性成分射干苷的最大吸光波长（266nm）的附近，而其他非黄酮类成分在此波长下影响不大，这样既能有效避开其他成分对黄酮测定的影响，又能保证结果的准确性。在本试验中，作者也曾用醋酸钾-三氯化铝显色法测定川射干须根中总黄酮含量，但结果不稳定，且常常偏高。本试验以射干苷为对照品，采用直接70%乙醇超声提取30 min，样品经过滤、稀释处理后直接测定总黄酮类成分的含量，结果显示该法操作快速、简便，结果准确可靠，可作为川射干须根中总黄酮的含量测定方法。

3.3应用前景川射干的代表性成分，如射干苷、射干苷元、二甲基射干苷元等均为异黄酮成分，药材中总黄酮含量的高低是实现药理作用的关键。川射干须根所含的代表性成分与药材相似，可能存在与川射干药材相似的药理作用。本试验通过紫外分光光度法测定川射干须根中总黄酮含量，建立了川射干须根中总黄酮的含量测定方法，为川射干这一传统药用资源的综合利用提供了参考依据。

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UV spectrophotometric determination of total flavonoid content in roots of Rhizoma Iridis Tectori*

Luo Sen，Yuan Chongjun，Chen Shuai，Wang Jia
（Sichuan Provincial Academy of Chinese Medicine Sciences，Chengdu，Sichuan 610041，China）

Objective To establish a method for the determination of total flavonoids content in the roots of Rhizoma Iridis Tectori.Methods The total flavonoids content in the roots of Rhizoma Iridis Tectori was determined by UV spectrophotometry with belamcandin as the control sample and the detection wavelength of 266 nm.Results Belamcandin in the range of 0.824 4-9.068 4 μg/mL showed good linear relationship with the absorbance（r=0.999 8），the average recovery rate was 100.45%，RSD=1.15%；the average content of total flavonoids in the roots of Rhizoma Iridis Tectori was 1.03%.Conclusion The established UV spectrophotometrical method is simple to operate，sensitive，accurate and has good repeatability and higher recovery rate，which can be used for the determination method of total flavonoids content in the roots of Rhizoma Iridis Tectori.

Spectrophotometry，ultraviolet；Flavone；Rhizome；Isofavones；Rhizome Iridis Tectori

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.21.004

A

1009-5519（2016）21-3270-02

四川省公益性科研院所基本科研资助项目（A-2014N-3）。

罗森（1982-），助理研究员，主要从事中药药学方面的研究。

（2016-05-20）