QuEChERS-UPLC-MRM-IDA Criteria-EPI测定红曲米中洛伐他汀

汪元符

（南昌市食品药品检验所，江西 南昌330038）

QuEChERS-UPLC-MRM-IDA Criteria-EPI测定红曲米中洛伐他汀

汪元符

（南昌市食品药品检验所，江西 南昌330038）

目的：针对红曲米，建立其中所含洛伐他汀化学成分的QuEChERS-超高效液相色谱-MRM扫描（多重反应监测）-IDA Criteria-增强子离子扫描（EPI）的检测方法。方法：色谱柱为Phenomenex Luna C18（2）100A（150 mm× 2.00 mm，3 μm）；柱温为35℃；流动相为10 mmol/L乙酸铵以乙酸调节pH值至3.0及乙腈，梯度洗脱；流速为0.2 mL/min；以优化后的质谱参数采集信号。结果：检出限浓度为0.5 ng/mL；定量限浓度为1.0 ng/mL；线性范围为定量限浓度～500 ng/mL；在线性范围内相关系数在0.99以上；加样回收率为99.0%～99.9%。结论：本方法准确，灵敏度高，专属性好；能用于红曲米中洛伐他汀化学成分的同时定性及定量检测。

QuEChERS-超高效液相色谱-MRM扫描（多重反应监测）-IDA Criteria-增强子离子扫描（EPI）检测法；红曲米；洛伐他汀

红曲米的使用至今已有 1 000多年的历史，李时珍在《本草纲目》中提到：“此乃人窥造化之巧者也”，“奇药也”，作为中药，它具有活血和健脾等功效。红曲霉属于真菌门、子囊菌亚门、不整子囊菌纲、散囊菌目、红曲科、红曲属［1］。红曲系通过现代生物工程技术分离出优质的红曲霉菌，经固体深层发酵精制而成一种纯天然绿色产品。本品性状为淡红色粉末，色调纯正，光热稳定性好，纯天然，安全无副作用，具有降血脂、血压、胆固醇，调节人体心脑血管健康、提高人体免疫力的医疗保健功效［2］。红曲菌能产生多种次级代谢产物，例如红曲色素、莫纳可林K（Monacolin K，MK）、γ-氨基丁酸（GABA）、抗氧化物质、降血压物质等［3］，1979年由日本学者远藤章从红曲霉发酵液中分离得到，称为 Monacolin K。由于其疗效显著、毒副作用小、耐受性好而日渐受到重视，是目前在保健食品中唯一应用的他汀类物质［4］。近年来，随着生产菌种和工艺的不断改进，红曲米中洛伐他汀的含量越来越高［5］，但并不是含量越高就越好。本法针对红曲米，建立其中所含洛伐他汀化学成分的QuEChERS-超高效液相色谱-MRM扫描（多重反应监测）-IDA Criteria-增强子离子扫描（EPI）的检测方法（QuEchERS-UPLC-MRM-IDA Criteria-EPI），能同时定性与定量对红曲米中的洛伐他汀进行测定，为红曲米的质量控制提供参考。

1 仪器、试剂与材料

AB Sciex 4000 Qtrap质谱，ekspert ultraLC100超高效液相色谱仪，METTLER TOLEDO ME204E电子分析天平，METTLER TOLEDO XS105电子分析天平，Hettich Rotina 380R 1706型医用低速离心机，昆山 KQ-300DB型数控超声波清洗器，Millipore超纯水系统。

试剂：乙腈（色谱纯，Merck），乙酸铵（优级纯，Macklin），甲酸（优级纯，Macklin），无水硫酸镁（优级纯），无水醋酸钠（优级纯），C18（粒度100 μm），PSA，石墨化碳。

对照品：洛伐他汀（批号：100600-200502），为中国食品药品检定研究院提供。

样品：购自市场和流通企业，产地分别为福建、湖北、山西、广东，共10个批次，批号：140107，140110，140201，140204，140206，140209，140310，140402，141046，141017，对应编号为① ～ ⑩。

2 方法与结果

2.1 高效液相色谱分析条件

分析柱：Phenomenex Luna C18（2）100A（150 mm×2.00 mm，3 μm）。柱温：35℃。流速：0.2 mL/min。进样量：5 μL。流动相：A为10 mmol/L乙酸铵以乙酸调节pH值至3.0，B为乙腈。按表1进行梯度洗脱。

表1 梯度洗脱程序

2.2 质谱分析条件

电喷雾离子源（ESI）：正离子模式（ESI+）。扫描模式：MRM扫描（多重反应监测）-IDA Criteria-EPI。扫描范围：50～650 Da。气帘气压力：25 Pa。碰撞气密度：中。电离喷雾电压：5 500 V。离子源温度：500℃。雾化气压力：55 Pa。辅助气压力：50 Pa。界面加热状态：开启。离子对选择见表2。

表2 质谱分析

2.3 对照品溶液的配制

取洛伐他汀对照品约10 mg，精密称定，以乙腈制成每1 mL中含1 mg的溶液作为对照品储备液。取对照品储备溶液以乙腈按一定比例稀释，可 得 到 各 含 0.5，1，2.5，5，10，25，50，100，250，500 ng/mL的标准系列工作液。

2.4 供试品溶液的配制

样品前处理：以四分法采样，取适量，研匀，称取0.5 g（精确到0.000 1 g），置50 mL量瓶中，加入乙腈约30 mL，超声萃取30 min，取出，冷却至室温后定容，以5 000 r/min离心，取上清液。

采用 QuEChERS法处理：取上述上清液约15 mL，加入适量的无水硫酸镁，无水醋酸钠，C18，PSA及石墨化碳，充分混合约5 min，以5 000 r/min离心，取上清液，经 0.2 μm微孔滤膜过滤后，取续滤液适当稀释后测定。

2.5 洛伐他汀离子对提取质谱图

见图1至图6。

综上所述，不仅东道国基础设施的完善有利于双边经济增长，而且东道国制度对于改善东道国基础设施的中国OFDI的双边经济增长效应也有着重要影响。以往关于“一带一路”的研究多将直接投资的经济增长效应与制度因素割裂开来，或者多研究东道国制度因素对中国OFDI整体的影响。本文着重从东道国各项制度出发，考察在“一带一路”背景下，东道国各项制度对中国直接投资，尤其是用于改善东道国基础设施的中国OFDI双边经济增长效应的影响。东道国制度不仅直接影响中国直接投资进入“一带一路”国家的风险和成本，更进一步影响中国直接投资的区域、类型和经济效果。[15]具体影响机理见图1。

图1 对照品浓度为100 ng/mL时总离子流质谱图

图2 对照品定量离子对（405.7/199.1）提取质谱图

图3 对照品定性离子对（405.7/285.3）提取质谱图

图4 样品总离子流质谱图

图5 样品定量离子对（405.7/199.1）提取质谱图

图6 样品定性离子对（405.7/285.3）提取质谱图

2.6 定性确认

采用保留时间与对照品相一致，且提取的二级质谱图与对照品相一致，判为检出。见图7～图8。

图7 对照品二级质谱图

图8 样品二级质谱图b（与对照品一致）

2.7 线性关系及检出限、定量限考察

采用“2.1”项下的色谱条件，“2.2”项下的质谱条件，以“2.3”项下的标准系列溶液进样检测。以检测所得峰面积为纵坐标，以标准系列溶液浓度（ng/mL）为横坐标，进行线性拟合。以定性离子对和定量离子对提取的质谱图信噪比均大于3时的浓度（ng/mL）为检出限。以定性离子对提取的质谱图信噪比大于3，定量离子对提取的质谱图信噪比大于10时的浓度（ng/mL）为定量限。以在一定浓度范围内，相关系数大于 0.99，为线性范围。结果见表3。

2.8 精密度试验

选用标准系列溶液中浓度为100 ng/mL的标准溶液，连续进样6针，以提取的定量离子对质谱图峰面积计算。结果见表4。

选用标准系列溶液中浓度为100 ng/mL的标准溶液，在0，1，2，4，8，12，24小时分别进样，以提取的定量离子对质谱图峰面积计算。结果见表5。

2.10 重复性试验

选用批号：140206的红曲米，按“2.4”项下的方法制备6份平行样品，按本法检测洛伐他汀的含量。结果见表6。

2.11 回收率试验

以同一批次样品试验，准确称取 0.50 g，按“2.4”项的方法制备供试液（稀释1 000倍），洛伐他汀的理论浓度为98.3 ng/mL，准确加入1.000，2.500，5.000 mL各含1 mg/mL的对照品储备液，再按 “2.4”项的方法制备成供试液 （稀释1 000倍），进行检测，以3次平行结果的均值计，结果见表8，高、中、低三个浓度的回收率均在99.5% ～100.1%之间。

2.12 样品测定结果

检测10批次样品，结果见表8。

表3 线性关系及检出限、定量限考察结果

表4 精密度试验结果

表5 稳定性试验结果

表6 重复性试验结果

表7 加标回收试验结果

表8 红曲米中洛伐他汀测定结果

3 讨论

3.1 供试品提取溶剂选择

据文献［6］，洛伐他汀易溶于乙酸乙酯而不溶于酸与水，红曲米中洛伐他汀含量测定中多用甲醇或乙醇超声提取，本法对此做了改变，采用乙腈为提取液，经比较同样能较好地提取红曲米中的洛伐他汀。

3.2 供试品前处理

据文献［7］，红曲米中洛伐他汀的前处理方法有直接超声法，超声提取后再经氧化铝层析柱纯化法，本法基于简单、便利、快捷的原则，采用QuEChERS法对供试品提取液进行进一步处理净化，排除了多余杂质及色素的干扰，能满足液质进样需要。

［1］ 逯慎杰，刘秀河.功能性红曲中功能成分的研究进展［J］.江苏调味副食品，2011，28（1）：17-20.

［2］ 杜珊.高效液相色谱法测定红曲中洛伐他汀的含量［J］.天津化工，2010，24（3）：54-60.

［3］ 黄志兵，许杨，张泓，等.红曲菌几种主要次级代谢产物及其生物活性的研究进展［J］.食品与发酵工程，2010，36（4）：143-148.

［4］ 姜楠，马壮飞，刘思洁，等.红曲类保健食品中洛伐他汀检测的方法研究［J］.中国卫生检验杂志，2013，23（1）：73-74.

［5］罗仁才，孙开奇，谢申猛，等.红曲中洛伐他汀总量的测定方法［J］.卫生研究，2003，32（2）：157-158.

［6］ 张艳红.高效液相色谱法测定红曲米中洛伐他汀的含量［J］.食品科学，2001，22（7）：67-69.

［7］ 范雯.高效液相色谱法测定红曲药材中洛伐他汀的含量［J］.现代医药卫生，2013，29（16）：2417-2419.

Determination of Lovastatin in Red Yeast Rice by QuEChERS-UPLC-MRM-IDA Criteria-EPI

Wang Yuanfu（Nanchang Institute for Food and Drug Control，Jiangxi Nanchang 330038，China）

Objective：To develop a QuEChERS-UPLC-MRM-IDA Criteria-EPI method for determination of lovastatin in red yeast rice.Methods：Phenomenex Luna C18（2）100A column（150 mm×2.00 mm，3 μm）was used at a column temperature of 35℃，serving 10 mmol/L ammonium acetate （pH 3.0）-acetonitrile as a mobile phase by gradient elution at a flow rate of 0.2 mL/min.Signals were collected under the optimized condition.Results：The detection limit of this method was 0.5 ng/mL，while the limit of quantitation was 1.0 ng/mL，and the linear range was the limit of quantitation～500 ng/mL.Within the linear range，the correlation coefficient was more than 0.99，while the sample recovery rate was 99.0%～99.9%.Conclusion：This method is accurate，sensitive and specific，which may be used for the qualitative and quantitative determinations of lovastatin in red yeast rice.

QuEChERS-UPLC-MRM-IDA Criteria-EPI；Red Yeast Rice；Lovastatin

10.3969/j.issn.1672-5433.2016.10.006

2016-05-22）

汪元符，男，主管医师。研究方向：中药理论、药物检测及食品安全。E-mail：wanngel@126.com