复方多西环素缓释凝胶体外释放度的测定

程凤峡，田　华，王志洁，刘　勇

(河北省人民医院，河北 石家庄 050051)



药物研究

复方多西环素缓释凝胶体外释放度的测定

程凤峡，田华，王志洁，刘勇

(河北省人民医院，河北 石家庄 050051)

[摘要]目的建立同时测定复方多西环素缓释凝胶中多西环素与柚皮苷含量的方法，考察其体外释放度。方法采用高效液相色谱(HPLC)法测定凝胶中多西环素和柚皮苷含量，采用转篮法测定其体外释放度。结果复方多西环素缓释凝胶中多西环素含量为99.80 mg/g，柚皮苷的含量为97.38 μg/g，凝胶的体外释放分为速释和缓释两个阶段。结论本方法简便可靠，可用于复方多西环素缓释凝胶中多西环素与柚皮苷含量以及体外释放度的测定。复方多西环素缓释凝胶中有效药物成分在体外缓慢释放可以达到缓释制剂要求。

[关键词]缓释凝胶；多西环素；柚皮苷；高效液相色谱法；释放度

牙周病是牙周组织的慢性感染性破坏性疾病，以菌斑细菌为始动因子，其最终结果将导致牙周袋形成，牙槽骨吸收，牙齿松动、脱落。牙周病的治疗一直是困扰临床医师的重要问题。近年来，局部用药尤其是局部缓释制剂受到越来越多的关注，但尚没有理想的制剂可应用于临床。多西环素不仅能抑制多种牙周致病菌，还能抑制胶原酶活性，减轻其对牙周组织的破坏[1]。研究证实骨碎补不但能刺激牙周膜细胞的增殖及骨分化潜能，且有利于成纤维细胞在牙面上的附着，在新附着形成中起重要作用[2-3]。复方多西环素缓释凝胶以多西环素和骨碎补为主药，聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)为缓释辅料[4]，使药物在牙周袋内缓慢释放，为临床牙周病治疗提供一种无创且方便有效的方法。本试验对此缓释凝胶的体外释放度进行初步探讨。

1实验资料

1.1仪器岛津LC-20AT高效液相色谱仪，Kromasil C18(100 mm×4.6 mm,5 μm)，SPD-M20A紫外检测器，LCsolution色谱工作站，梅特勒AG-254电子天平，ZRS-4智能溶出试验仪。

1.2试剂多西环素对照品(批号：0485-0401)、柚皮苷对照品(批号：110722-200610)，均由中国药品生物制品检定所提供。多西环素原料，由华北制药集团提供。骨碎补由河北省人民医院中药房提供，产地为广西。1-甲基-2-吡咯烷酮(lMP)、三乙酸甘油酯(GAT)均为分析纯，由北京奇松生物科技有限公司提供。聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)由长春圣博玛生物材料有限公司提供，乳酸：羟基乙酸为75∶25。复方多西环素缓释凝胶，自制。

1.3凝胶制备骨碎补煎煮2遍，过滤，加热浓缩，醇沉，配制成质量浓度为每毫升含1 g生药的骨碎补提取液。精密称取600 mg PLGA 75∶25，用混合溶剂(1MP∶GAT=7∶3)1 mL溶解，待完全溶解后，加入多西环素原料200 mg和骨碎补提取液20 μL，最后加入混合溶剂至2 g，漩涡震荡。4 ℃避光保存。

1.4方法

1.4.1测定方法由于中药骨碎补成分复杂，本实验采用骨碎补主要成分柚皮苷作为凝胶中骨碎补含量和释放度测定的指标。采用高效液相色谱法对凝胶中多西环素和柚皮苷进行定量分析，采用转篮法对多西环素和柚皮苷进行体外释放度测定。

1.4.2测定条件色谱柱：Kromasil C18(100 mm×4.6 mm,5 μm)，HPLC分析条件见表1。用氨水调流动相B pH值到8.0左右，流速1.0 mL/min；柱温室温；检测波长280 nm。

表1　流动相条件

1.4.3标准曲线取多西环素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL中含多西环素1 000 μg的溶液,作为对照品溶液A。精密称取对照品溶液A适量，用甲醇稀释至浓度分别为50,100,200,300,400,500 μg/mL，进样10 μL测定峰面积，以峰面积对浓度进行线性回归，得出回归方程为:A=2 710.7Cx+11 249，r=0.999 5。结果表明,多西环素在50～500 μg/mL范围内线性关系良好。取柚皮苷对照品，110 ℃干燥至恒重，精密称定，用甲醇配成10 μg/mL的柚皮苷溶液，作为对照品溶液B。精密量取对照品溶液B, 用甲醇稀释成浓度分别0.025，0.05，0.1，0.2，0.4，0.6 μg/mL，分别进样20 μL，测定峰面积，并以峰面积对浓度进行线性回归，得出回归方程A=398 545Cx+299.86，r=0.999 8，柚皮苷在0.025～0.6 μg/mL的范围内线性关系良好。多西环素和柚皮苷对照品的色谱图见图1。

A为柚皮苷，B为多西环素

1.4.4精密度试验取2.3步骤中200 μg/mL的多西环素溶液和0.1 μg/mL的柚皮苷溶液各连续进样5次，多西环素和柚皮苷峰面积的RSD分别为0.85%和0.97%，表明该方法精密度良好。

1.4.5重复性试验取5份复方多西环素缓释凝胶样品约0.1 g，精密称定，加适量三氯甲烷溶解，转至25 mL分液漏斗中，用甲醇5 mL萃取4次，合并甲醇层，置100 mL棕色量瓶中加甲醇至刻度，摇匀，过滤，取滤液进样20 μL。结果凝胶中多西环素和柚皮苷含量平均值分别为99.83 mg/g，柚皮苷的含量为97.51 μg/g， RSD分别为1.34%和0.98%，表明该方法重复性良好。

1.4.6辅料干扰试验取不含多西环素及骨碎补提取液的空白凝胶约0.1 g注射到甲醇溶液100 mL中，过滤，取滤液进样20 μL, 在波长280 nm下，辅料在多西环素和柚皮苷的保留时间处无吸收，不干扰测定。

1.4.7溶液稳定性试验取2.3中浓度为100 μg/mL多西环素对照品溶液在2,4,6,8,10 h进样，进样量为10 μL，测得其峰面积日内RSD为1.57%。取浓度为0.1 μg/mL的柚皮苷对照品溶液在2,4,6,8,10 h进样，进样量为10 μL，测得其峰面积日内RSD为0.78%。表明溶液稳定性良好。

1.4.8回收率试验制备复方多西环素凝胶样品5份，各1 g，其中加入有效药物为精密称定的多西环素和柚皮苷对照品，见表2，精密称定约0.1 g， 按照2.5的方法处理制成供试溶液，进样检测。

1.4.9含量测定取复方多西环素缓释凝胶制剂5份，精密称重，按照2.5下方法测定，记录峰面积，计算凝胶中多西环素平均含量为99.80 mg/g，柚皮苷的含量为97.38 μg/g。

表2　回收率试验结果

1.4.10体外释放度试验依据2010年版《中国药典》附录XC转篮法测定其释放度[5]。取复方多西环素缓释凝胶约200 mg，精密称定，放于溶出仪的圆底烧瓶内，烧瓶遮盖避光。介质为100 mL脱气蒸馏水，转速50 r/min，温度(37±0.5)℃，在第2，6，10，24，48，72，96，120，144，168 h取样，每次取样2 mL，补充脱气蒸馏水2 mL。取释放液离心，取上清液，进样20 μL，记录多西环素及柚皮苷的峰面积并计算出二者的相对累积释放百分率。结果见图2。

图2　复方多西环素缓释凝胶中多西环素和

3讨论

牙周袋内缓释药物的应用因其方便、无创、药效持续时间长等优点逐渐成为牙周病药物治疗的发展趋势。牙周局部缓释用药的理想标准包括：药物可持续释放较长时间发挥作用，减少毒副作用；对牙周致病菌有较强的杀灭或抑制作用；可促进牙周组织再生；减少上药频率，提高患者依从性；药物可贴附在牙周袋中不易脱落，无不适；缓释载体有良好的生物相容性，可生物降解；剂型便于临床操作，能深入牙周袋底及根分叉处等；但目前临床尚没有一种制剂能满足这些要求[6-7]。

本研究中复方多西环素缓释凝胶采用的治疗药物为多西环素和骨碎补，在牙周治疗中起到抑菌、抗胶原酶、促进牙周成纤维细胞的成骨分化及在牙面附着等多重作用；PLGA作为缓释辅料能明显延长药物释放时间，且具有良好的生物相容性，可降解，已被FDA正式批准为药用辅料[8]；1MP作为溶剂，GTA作为增塑剂，均有良好的生物降解性能，对凝胶最终的物理性状起到重要作用，满足了牙周局部凝胶应用方便，可深入牙周袋底部及根分叉区，药物缓慢释放，不易脱落，异物感小等要求。

本试验曾尝试过不同比例的乙腈-磷酸水溶液、乙腈-醋酸铵水及甲醇-醋酸水溶液等多种流动相，最终采用甲醇-醋酸铵水溶液进行梯度洗脱的方法，能将多西环素和柚皮苷较好的分离，峰形稳定，可以作为复方多西环素缓释凝胶中这两个成分测定的方法。由于多西环素遇光不稳定，在整个试验过程均应注意遮光操作，避免其分解。

本实验中凝胶遇水凝结成膜状，因此笔者参照固体制剂的体外释放度的试验方法，研究其体外释放度。缓释辅料PLGA遇水凝结形成多孔道骨架，药物可沿多孔道缓慢释放[9]，结果表明该凝胶的体外释放可持续长达7 d。而开始阶段的速释可能是是由于凝胶遇水后溶于水的溶剂与水置换导致，同时药物通过表面的孔道也释放较快。总之，药物体外释放基本达到缓释制剂的要求，而在牙周袋内的药物释放有待于进一步探讨。

[参考文献]

[1]曹采方. 临床牙周病学[M]. 北京：北京大学出版社，2006:279

[2]胡其勇，陈莉丽，王仁飞. 骨碎补柚皮苷对人牙周韧带细胞增殖和成骨分化潜能的影响[J]. 浙江大学学报：医学版，2010，39(1)：79

[3]刘斌，司徒镇强，吴军正，等. 枸杞和骨碎补对HGF体外附着影响[J]. 中华口腔医学杂志，1992，27(3)：159

[4]Eickholz P,Kim TS,Burklin T,et al. Non-surgical periodontal therapy with adjunctive topical doxycycline:a double-blind randomized controlled multicenter study[J]. J Clin Periodontol,2002,29(2):108

[5]中华人民共和国卫生部药典委员会. 中国药典(二部)[S]. 北京：中国医药科技出版社，2010：附录85

[6]毛永利，刘鲁川. 牙周药物缓释系统研究进展[J]. 口腔医学，2008，28(5)：271

[7]Jain N,Jain G,Javed S,et al. Recent approaches for the treatment of periodontitis[J]. Drug Discovery Today,2008,13(21):932

[8]The United States Pharmacopoeia Commission Inc. The United S-tates Pharmacopoeia 32-NF27[S]. Rockville: The United States Pharmacopoeia Convention,2009:2212

[9]Stoller NH,Johnson LR,Trapnell S,et al. The pharmacokinetic profile of a biodegradable controlled-release delivery system containing doxycycline compared to systemically delivered doxycycline in gingival crevicular fluid,saliva,and serum[J]. J Periodontol,1998,69(10):1085

[收稿日期]2015-08-20

[中图分类号]R285.5

[文献标识码]B

[文章编号]1008-8849(2016)04-0433-03

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.04.033

[基金项目]河北省医学科学研究重点课题计划指令课题(20110001)