HPLC—DAD法同时测定清肺宁嗽丸中4种成分的含量

李宪刚　于远洋　董斌　张敬武

[摘要] 目的 建立用HPLC-DAD同时测定清肺宁嗽丸中甘草苷、柚皮苷、橙皮苷、黄芩苷4种成分含量的方法。 方法 采用安捷伦TC-C18（4.6mm×250mm，5μm）为色谱柱，以乙腈为流动相A，0.1%磷酸溶液为流动相B，梯度洗脱（0～8min，19%A；8～30min，19%A→50%A），流速1.0mL/min；检测波长为280nm。 结果 甘草苷、柚皮苷、橙皮苷、黄芩苷线性范围分别0.03208～0.3208μg（r=0.9992），0.03206～0.3206μg（r=0.9992），0.01720～0.1720μg（r=0.9994），0.2991～2.991μg（r=0.9999）；平均加样回收率（n=6）均在97.2%～101.3%范围内；RSD均小于2.0%。 结论 本研究建立的方法符合方法学验证要求，适用于同时测定清肺宁嗽丸中甘草苷、柚皮苷、橙皮苷、黄芩苷的含量。

[关键词] 清肺宁嗽丸；HPLC-DAD；甘草苷；柚皮苷；橙皮苷；黄芩苷

[中图分类号] R927.2 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2016）09-36-04

[Abstract] Objective To establish a method for simultaneous determination of liquriritin， naringin， hesperidin and baicalin four ingredients in Qingfei Ningsou Pills by HPLC-DAD. Methods The determination was performed by HPLC on Agilent TC-C18（4.6mm×250mm，5μm） column， The mobile phase consisted of acetonitrile （A）- 0.1% phosphoric acid solution （B） with gradient elution （0-8 min，19%A；8～30 min，19%A→50%A）at a flow rate of 1.0 mL·min-1； The detection wavelength was 280 nm. Results The calibration curves were linear in the range of 0.03208-0.3208μg（r=0.9992） for liquriritin，0.03206-0.3206μg （r=0.9992）for naringin，0.01720-0.1720μg（r=0.9994） for hesperidin，0.2991-2.991μg （r=0.9999）for baicalin. All recoveries （n=6） were within the range of 97.2%-101.3%， RSD values was less than 2.0%. Conclusion The established method of the article is consistent with the method validation requirements and can be used for simultaneous determination of liquriritin， naringin， hesperidin and baicalin in Qingfei Ningsou Pills.

[Key words] Qingfei Ningsou pills； HPLC-DAD； Liquriritin； Naringin； Hesperidin； Baicalin

清肺宁嗽丸由同药集团大同制药有限公司研制，具有清肺、止咳、化痰功能，用于肺热咳嗽，痰多粘稠。该中药复方制剂由黄芩、枳壳、甘草、橘红等十三味中药材粉碎，过筛，混匀而制成。质量标准收载于中华人民共和国卫生部药品标准中药成方制剂第五册[1]，标准编号：WS3-B-1028-91，现行质量标准中尚无含量测定检验项目。由于其成分复杂，为实现对其进行有效的质量控制，建立准确、简单的分析方法至关重要。本研究查阅相关文献，建立HPLC-DAD梯度洗脱法在同一色谱条件下对中4种活性成分（甘草苷[2-3]、柚皮苷、橙皮苷[4-6]、黄芩苷[7-8]）同时测定的检测方法，采用该方法可有效地对清肺宁嗽丸的质量进行评估，为更全面有效地控制产品质量提供依据。

1 仪器与材料

Waters e2695高效液相色谱仪，配备waters2998二极管阵列检测器（DAD）、电子天平Sartorius BP211D②。甲醇、乙腈为色谱纯，硅藻土为化学纯（上海市奉贤奉城试剂厂），水为超纯水。

对照品甘草苷（批号：111610-201106）、柚皮苷（批号：110722-201312）、橙皮苷（批号：110721-201316）、黄芩苷（批号：110715-201318）均购自中国食品药品检定研究院。清肺宁嗽丸，（同药集团大同制药有限公司，Z14020286），为大蜜丸，每丸重9g。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 混合对照品溶液 取甘草苷、柚皮苷、橙皮苷、黄芩苷对照品适量，加甲醇溶液溶解并稀释成含甘草苷0.1604mg/mL、柚皮苷0.1603mg/mL、橙皮苷0.0860mg/mL、黄芩苷1.4957mg/mL的混合对照品储备溶液。精密量取上述溶液5mL，置50mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，作为混合对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液 取供试品3丸，剪碎，混匀，取适量，精密称定，精密加入半量的硅藻土，研匀，取2.0g，精密称定，加入70%乙醇100mL，称定重量，加热回流1h，放冷，再次称定重量，用70%乙醇补足减重，过滤，即得。

2.1.3 阴性样品溶液 按清肺宁嗽丸的制备工艺，分别制成不含黄芩、枳壳、甘草和橘红的阴性样品。按“2.1.2”项下方法制备阴性样品溶液。

2.2 色谱条件

色谱柱：安捷伦TC-C18（4.6mm×250mm，5μm）；流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脱（0～8min，19%A；8～30min，19%A→50%A）；流速1.0mL/min；柱温：30℃；检测波长：280nm。分别精密吸取上述混合对照品溶液、供试品溶液及阴性对照溶液各10μL，注入液相色谱仪进行测定。4种成分分离度均大于2.0。理论板数以4个目标成分计均不低于5000。

2.3 专属性试验

取混合对照品溶液、供试品溶液及阴性样品溶液各10μL，按“2.2”色谱条件下进行测定，记录色谱图（图1）。结果阴性样品的色谱图中，在与对照品色谱图相同的保留时间位置上未见色谱峰，说明阴性无干扰，该法专属性良好。

2.4 线性关系考察

取混合对照品溶液，依次进样2，5，10，15，20μL，按“2.2”项下色谱条件测定。结果表明甘草苷、柚皮苷、橙皮苷、黄芩苷的进样量分别在0.03208～0.3208 μg， 0.03206～0.3206μg，0.01720～0.1720μg，0.2991～2.991μg范围内与峰面积呈良好线性关系，以对照品的浓度X为横坐标，测得的峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线，得甘草苷、柚皮苷、橙皮苷、黄芩苷回归方程分别为：Y=2.1778×106X-11889，r=0.9992；Y=2.1749×106X+2522.4，r=0.9992；Y=2.3814×106X-2696.1，r=0.9994；Y=3.6839×106X-35878，r=0.9999。

2.5 精密度试验

取一份混合对照品溶液，连续进样6次，每次10μL，测定峰面积，计算甘草苷、柚皮苷、橙皮苷、黄芩苷峰面积的RSD分别为0.45%，0.21%，0.57%，0.91%。

2.6 重复性试验

取同一批号清肺宁嗽丸样品5丸，剪碎，混匀，分别按“2.1.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，按上述“2.2”色谱条件分别进样10 μL，结果样品中的甘草苷、柚皮苷、橙皮苷、黄芩苷含量RSD分别为1.6%，1.5%，1.9%，1.0%。表明其重复性良好。

2.7 稳定性试验

取同一供试品溶液，在0，2，4，8，12，24 h分别进样10μL，结果甘草苷、柚皮苷、橙皮苷、黄芩苷峰面积的RSD分别为0.48%，0.96%，0.49%，0.62%。表明供试品溶液在室温放置24h内基本稳定。

2.8 加样回收率试验

精密称取已知含量的同一批样品（批号20150601）6份各1.0 g，分别精密加入对照品储备溶液10mL，加入70%乙醇90mL，按“2.1.2”项下方法制备供试溶液，按上述色谱条件分别进样10μL，计算回收率，结果见表1～4。

2.9 样品测定

取清肺宁嗽丸3批（为对企业质量数据保密，产品批号以代码标识），按照“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件分别进样10μL，进行测定，以外标法计算含量，结果见表5。

3 讨论

3.1 提取溶剂和方法的选择

为能兼顾甘草苷[9]、柚皮苷[10-11]、橙皮苷[12]、黄芩苷[13]的提取溶剂和方法[14]的要求，并参考中国药典[15]制备方法，本试验对不同提取溶剂（甲醇、乙醇）进行考察，结果表明四种被测组分在乙醇中提取效率较高，于是进一步考察了用不同浓度的乙醇溶液提取对样品含量的影响，试验对同一批样品，分别考察了用乙醇、70%乙醇、50%乙醇提取的样品，实验结果表明三种提取溶剂中以70%乙醇提取的样品中黄芩苷和柚皮苷的含量最高；试验比较了超声提取和加热回流提取的方法，结果表明加热回流提取方法提取效率较高，并对提取时间（30、60、120min）进行考察，最终选用70%乙醇溶液加热回流60min作为供试品溶液的提取制备方法。

3.2 检测波长的选择

对被测组分在200～400nm范围内进行DAD检测，甘草苷在277nm处有最大吸收；柚皮苷在283nm处有最大吸收；橙皮苷在283nm处有最大吸收；黄芩苷在280nm处有最大吸收。兼顾4种活性成分紫外最大吸收波长，经过研究确定280nm为本实验的吸收波长。方法学考察结果表明该波长下实验方法精密、稳定、准确。

3.3 流动相的选择

比较乙腈-水、甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液等流动相系统进行等度及梯度洗脱，综合考虑分离效果、峰型、分析时间等因素，最后确定乙腈-0.1%磷酸溶液梯度洗脱作为流动相系统。

3.4 小结

清肺宁嗽丸现行质量标准仅对黄芩等药材进行显微和薄层鉴别，不能全面反映该制剂的质量，本研究所建立的检验方法可对清肺宁嗽丸处方中4个活性成分进行定量分析，方法简便、准确、重复性好，为有效控制中药复方制剂质量并进一步提升质量标准提供了研究数据和参考方法[16]。

[参考文献]

[1] 原卫生部. 卫生部药品标准（中药成方制剂第五册）[S]. 1992：166.

[2] 文谨， 刘起华，王菲. HPLC同时测定参柏颗粒中甘草苷、柚皮苷、盐酸小檗碱[J]. 中草药， 2011（10）：2005-2007.

[3] 傅勇，李旭，虞金宝. HPLC同时测定红花逍遥片中芍药苷及甘草苷含量[J]. 中国实验方剂学杂志， 2012， 18（24）：152-154.

[4] 宋剑锋，冯敬骞，胡建华，等. HPLC法同时测定常山胡柚花中柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的量[J]. 中草药，2014， 45（6）：854-856.

[5] 康四和，周锐，聂晶. HPLC测定小儿消积止咳口服液中柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的含量[J]. 中成药，2010， 32（12）：2088-2091.

[6] 赵奎君，郑玉忠，董婷霞，等.不同产地枳壳药材HPLC指纹图谱及其柚皮苷、新橙皮苷和辛弗林含量分析[J]. 中国药学杂志， 2011（12）：955-959.

[7] 滕宇，卢静华. RP-HPLC法同时测定地榆槐角丸中芍药苷、橙皮苷和黄芩苷[J]. 中成药， 2013（9）：1929-1932

[8] 张婷，美尔哈巴·热西提，林潇，等.HPLC-MS/MS法测定银黄颗粒中绿原酸和黄芩苷[J]. 中草药，2012（4）：711-713

[9] 赵镭，师清芝，唐星，等.甘草中甘草酸和甘草苷的提取纯化工艺研究[J]. 中国药房，2009，20（6） ： 426-429.

[10] 周石磊，王鸿飞，杜洁雄.柚皮中柚皮苷乙醇提取工艺研究[J]. 农业工程学报， 2006， 22（7）：184-187.

[11] 刘学仁.柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的提取与分析研究[D]. 黄石：湖北师范学院， 2011：27-29.

[12] 牛辉，于宏伟，韩明会，等.醇溶剂提取橙皮苷进展研究[J]. 河北化工，2010，33（8）：7-8.

[13] 蒋巍，田艳，刘艳杰. 注射用黄芩甙提取工艺研究[J]. 广东化工，2014（18）：42-43

[14] 吕阳成，骆广生，戴猷元.中药提取工艺研究进展[J]. 中国医药工业杂志，2001（5）：232-235.

[15] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典一部[S]. 北京：中国医药科技出版社，2010：491.

[16] 王锐，陆铖，葛斌，等. HPLC-DAD法同时测定消乳增胶囊的三种活性成分[J].西部中医药，2015，28（3）：25-28.

（收稿日期：2016-01-21）