红景天对大鼠肝纤维化肝脏中HAb18G/CD147的表达①

刘东璞，卢凤美，盛延良，孟庆媛，张　辉

(佳木斯大学司法鉴定中心，黑龙江佳木斯154007)



红景天对大鼠肝纤维化肝脏中HAb18G/CD147的表达①

刘东璞，卢凤美，盛延良，孟庆媛，张辉

(佳木斯大学司法鉴定中心，黑龙江佳木斯154007)

摘要:目的:探讨红景天对四氯化碳(CCl4)诱导的大鼠肝纤维化肝组织中HAb18G/CD147基因表达的影响。方法:健康♂SD大鼠60只随机分组: (1)对照组(20只)，腹腔给予橄榄油和生理盐水ig; (2)模型组(20只)，以CCl4ip法诱导大鼠肝纤维化; (3)干预组(20只)，在造模的同时给予红景天ig。8 wk实验结束时处死动物，留取部分肝脏组织做HE，部分应用半定量RT－PCR检测HAb18G/CD147mRNA的表达情况，部分用免疫组化检测肝组织中HAb18G/CD147的表达。结果:干预组大鼠肝组织中HAb18G/CD147mRNA及蛋白阳性表达阳性率明显均低于模型组(P＜0.05) ;肝组织HAb18G/CD147蛋白表达与HAb18G/CD147mRNA水平变化成正相关。结论:中药红景天能有效抑制CCl4诱导的肝纤维化大鼠肝脏中HAb18G/CD147表达。

关键词:红景天;肝纤维化; HAb18G/CD147

肝纤维化是各种肝脏慢性疾病向肝硬化发展的重要环节［1］，实验研究证实肝纤维化阶段是可逆的病理变化，因此在肝脏慢性疾病过程中控制肝纤维化进展可有效防止肝硬化的发生，具有极为重要的临床意义。通过动物实验证实中药红景天可以保护肝细胞，同时调节机体免疫功能，从而抑制肝纤维化的发展。HAb18G/CD147又称EMMPRIN(细胞外基质金属蛋白酶诱导因子)，属于免疫超家族成员，是一种分子量43－66 kDa的跨膜糖蛋白，在多种起源于上皮组织的肿瘤以及炎症组织中表达。其作用机制为诱导肿瘤细胞和基质细胞产生多种基质金属蛋白酶(MMP－1、MMP－2、MMP－9)使细胞外基质降解，从而促进肿瘤细胞的浸润和转移［2］。同时研究发现肝硬化组织中在窦周间隙HAb18G/CD147高表达，这提示HAb18G/CD147在肝纤维化发展过程中具有重要作用［3］。本文应用半定量RT－PCR技术及免疫组化技术，以HAb18G/CD147为靶基因，检测四氯化碳(CCl4)诱导大鼠肝纤维化模型中HAb18G/CD147的表达，同时观察红景天对肝纤维化模型中HAb18G/CD147表达的影响，进一步探讨红景天干预实验性大鼠肝纤维化的可能分子机制及治疗肝纤维化的最佳药物浓度。

1　材料和方法

1.1材料

健康♂SD大鼠60只，体重180～220g，购于佳木斯大学实验动物中心。红景天胶囊购自广东长兴科技尊然健康管理有限公司。四氯化碳(CCl4)购自郑州宇腾化工厂。HAb18G/CD147上下游引物、兔抗鼠一抗、组织RNA提取试剂盒及逆转录试剂盒、辣根过氧化物酶(HRP)标记的免疫组化通用型羊抗兔的二抗工作液购于上海颖心实验设备有限公司。

1.2方法

1.2.1分组:健康SD♂大鼠60只，随机分组(各组间暴露因素无差别，P＞0.05)。(1)对照组(20 只) :腹腔给予橄榄油和生理盐水灌胃; (2)模型组(20只) :以CCl4ip法诱导大鼠肝纤维化，(橄榄油稀释100mL/L CCl4，每周1次1mL/kg，共8wk) ; (3)干预组(20只) :同模型组，同时给予浓度40g/L红景天(剂量10mL/kg) 2次/W灌胃(共8wk)。在实验第8周注射CCl4后48h处死，提取大鼠肝脏，部分组织用10%福尔马林固定，其余肝组织置－80℃冰箱冻存。(试验中所有试剂CCl4及红景天的最佳剂量均在前期试验中探索出)。

1.2.2常规HE病理学检查。

1.2.3肝组织中HAb18G/CD147mRNA RT－PCR检测:冻存肝组织TRIzol一步法PCR反应。置于凝胶分析系统中进行电泳条带的分析。HAb18G/ CD147:上游: 5＇－ACTCCTCACCTGCTCCTTGA－3＇，下游:5＇－GCCTCCATGTTCAGGTTCTC－3＇，长度528bp;同时扩增GAPDH基因作为内参，每一个反应设置3复孔。GAPDH:上游: 5＇－GCACCGTCAAGGTCAAGAAC－3＇，下游: 5＇－TGGTGAAGACGAGACTGGA －3＇长度500bp。采用25μl的反应体系反应条件是: 95℃3min; 95℃30s，57℃30s，72℃30s，39个循环; 72℃10min; PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后用Bio－RadGel Doc2000型凝胶成像系统照像并用Quangtity-One软件计算基因相对表达值。

1.2.4免疫组织化学检测HAb18G/CD147:用二步法检测肝组织中HAb18G/CD147。

1.3统计学方法

2　结果

2.1肝纤维化分期

本单位资深临床病理主任医师阅片。模型组20只大鼠均形成明显肝纤维化(15只为3期以上，1只为早期肝硬化，其余纤维化程度均超过2期)，干预组大鼠肝组织纤维化程度均较模型组明显减轻。

2.2 HAb18G/CD147表达情况

模型组与对照组比较HAb18G/CD147mRNA的表达显著增高(P＜0.05) ;干预组HAb18G/ CD147mRNA的表达较模型组显著降低(P＜0.05，表1，图1)。HAb18G/CD147在正常肝组织中可见微弱表达，主要见于窦周间隙中。模型组中HAb18G/CD147的表达较对照组显著增强，主要表现为胞浆着色，差异有统计学意义(P＜0.05)。红景天干预组HAb18G/CD147的表达低于模型组，差异有统计学意义(P＜0.05，表1，图2)。

图2　肝组织中HAb18G/CD147表达A对照组B模型组C干预组

表1　肝组织HAb18G/CD147表达的变化(±s，n =20)

表1　肝组织HAb18G/CD147表达的变化(±s，n =20)

aP＜0.05 vs模型组

分组HAb18G/CD147　 HAb18G/CD147mRNA正常组　0.212±0.057a　0.498±0.057a模型组　0.546±0.049　0.861±0.049干预组　0.321±0.029a　0.598±0.029a

1 Marker 2对照组3模型组4～6干预组图1　肝组织中HAb18G/CD147 mRNA表达的变化

3　讨论

肝纤维化是多种慢性肝脏疾病发展为肝硬化的重要环节。肝脏长期受多种损伤因素刺激，使肝窦内肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)活化，使肝组织内细胞外基质(extracellular matrix，ECM)过度增生与沉积，致肝脏组织结构或(和)功能异常。HAb18G/CD147于1982年被发现，属于免疫球蛋白超家族(IgSF)成员。促进MMP－3、MMP－9的分泌诱导肝纤维化。研究显示在角膜成纤维细胞中HAb18G/CD147通过促进α－SMA表达有效促进角膜组织结构的重建与创伤修复。HAb18G/CD147诱导MMPs产生的MMP－3、MMP－9活化TGF－β，因此推断HAb18G/CD147、MMP－3、MMP－9和TGF－β1之间呈正反馈效应［4～6］。另外，发现HAb18G/CD147在乳腺癌中可以活化成纤维细胞，从而诱导癌细胞进行上皮－间质转化，激活了肿瘤和基质的相互作用［7，8］。通过动物实验证实红景天具有保护肝细胞及有效调节机体免疫等功能，具有抑制四氯化碳(CCl4)诱导的肝纤维化发展的良好作用［9，10］。有较多红景天抑制肝纤维化的报道，红景天对肝纤维化组织内相关成分表达的影响也有各案报道［11～13］。红景天抑制肝癌的报道，红景天对肝癌组织内相关成分表达的影响也有各案报道［14］。本文应用免疫组织化学染色与半定量RT－PCR的方法观察红景天对纤维化肝组织中HAb18G/CD147表达的影响，大鼠肝组织HAb18G/CD147的表达减少，明显低于模型组，高于对照组，结果显示红景天可以较好防治CCl4损伤性肝纤维化。证实了红景天具有通过抑制HAb18G/CD147的表达保护HSC及其周围正常的基底膜样细胞，抑制HSC的活化与肝纤维化的发展。在四氯化碳(CCl4)诱导的肝纤维化模型中HAb18G/CD147的表达水平增加，在红景天干预过程中HAb18G/CD147的表达下降，提示HAb18G/CD147与肝纤维化的发生发展具有密切的关系，红景天可有效抑制肝纤维化。

目前对红景天治疗肝纤维化的作用机制尚未不清楚，仍需进一步的实验研究阐明。尤其是肝纤维化形成过程，红景天对大鼠肝星状细胞、HAb18G/ CD147表达的影响机制有待进一步深入研究。本实验对红景天的临床抗肝纤维化的药用价值提供可靠的实验根据。在今后的临床工作中，可通过目标基因对肝纤维化的发展过程、肝纤维化程度以及治疗效果进行有效评估［15，16］。为临床抗肝纤维化，阻断肝纤维化的发展提供实验理论依据。

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(收稿日期:2015－12－17)

通讯作者:卢凤美(1970～)女，黑龙江佳木斯人，硕士，副教授。E－mail: liudongpu1220@163.com。

作者简介:刘东璞(1969～)男，黑龙江佳木斯人，硕士，副教授，硕士研究生导师。

基金项目:①1.佳木斯大学面上项目，编号: S2014－001; 2.佳木斯大学面上项目，编号: S2013－036。

中图分类号:R575

文献标识码:A

文章编号:1008－0104(2016) 02－0037－02