扶正化瘀方抗肝纤维化的主要作用机制与效应物质

赵志敏+刘成海

摘 要 扶正化瘀方是治疗肝纤维化的有效中药复方，本文综述了扶正化瘀方抗肝纤维化的主要作用机制及其效应物质，包括该方影响肝脏多种细胞的功能及细胞外基质代谢，其入血成分、活性物质及其组织分布代谢特征。

关键词 扶正化瘀方 肝纤维化 作用机制 效应物质

中图分类号：R286 文献标识码：A 文章编号：1006-1533（2016）13-0013-04

The main mechanism and the substantial basis of FZHY recipe in the treatment of hepatic fibrosis*

ZHAO Zhimin1，2**， LIU Chenghai1，2，3***（1. Institute of Liver Diseases， Shuguang Hospital， Shanghai University of Traditional Chinese Medicine， Shanghai 201203， China； 2. Shanghai Key Laboratory of Traditional Chinese Clinical Medicine， Shanghai 201203， China； 3. E-institute of TCM Internal Medicine， Shanghai Municipal Education Commission， Shanghai 201203， China）

ABSTRACT Fuzheng Huayu recipe （FZHY） is an effective traditional Chinese medicine for the treatment of liver fibrosis.

This review summarizes the main mechanism and the substantial basis of FZHY recipe in the treatment of hepatic fibrosis， including its effects on the function of multiple types of cells in liver and extracellular matrix metabolism， the blood components and active substances and their characteristics of tissue distribution and metabolism.

KEY WORDS FZHY recipe； liver fibrosis； mechanism； substantial basis

肝纤维化的中医基本病机为“正虚血瘀”，正虚主要表现为气阴两虚，血瘀则主要表现为瘀血阻络。扶正化瘀方（制剂为扶正化瘀胶囊/片）立足于中医“血瘀阻络、正气亏虚”的基本病机，由丹参、冬虫夏草、桃仁、松花粉、绞股蓝、五味子等6味中药组成。可改善肝炎后肝硬化患者肝功能、调整异常免疫功能和降低血清肝纤维化标志物水平等，对乙肝肝纤维化的组织学逆转率达52%，且肝组织炎症活动度也有明显改善[1]。抗丙肝肝纤维化美国多中心Ⅱ期临床试验也显示出该药良好作用。对其主要作用机制与效应物质，近年也有较多研究，归纳于下。

1 扶正化瘀方影响肝纤维化的作用机制

1.1 抑制肝星状细胞活化

肝星状细胞（hepatic stellate cells，HSC）的活化是肝纤维化的中心环节，其激活途径包括肝细胞损伤后形成脂质过氧化产物、胞外基质（extracellular matrix，ECM）改变与肝库普弗细胞等激活后分泌细胞因子的旁分泌刺激，以及星状细胞活化后自身分泌细胞因子以刺激与维持细胞活化的自分泌作用，细胞因子以转化生长因子-b1（transforming growth factor β1，TGF-b1）与血小板衍生生长因子bb（platelet derived growth factor-bb，PDGF-bb）作用尤为显著。扶正化瘀方抑制纤维化大鼠肝组织a-平滑肌肌动蛋白（a-smooth muscle actin，a-SMA）表达，其药物血清抑制正常传代活化、体外PDGF-bb刺激活化与肝纤维化大鼠体内活化的HSC增殖[2]，即抑制HSC活化，进一步研究发现其细胞分子药理机制如下。

1）抑制HSC的自分泌活化 5%～20%扶正化瘀药物血清能浓度依赖性抑制传代活化HSC细胞内外胶原生成率，尤其以抑制细胞外胶原分泌率最为显著，并抑制I型胶原的分泌量及其I型前胶原mRNA表达[3]。活化星状细胞的条件培养液可显著促进静止星状细胞的增殖与I型胶原分泌，但经药物血清温育条件培养液后，静止星状细胞的促细胞增殖与胶原生成作用则明显减弱[4]。表明扶正化瘀方抑制活化星状细胞的功能，并通过抑制其自分泌作用，阻断活化的级联反应，从而阻止肝纤维化的持续发展。

2）抑制库普弗细胞的旁分泌 以CCl4诱导急性肝损伤大鼠模型，而后分离培养体内激活的库普弗细胞，继以扶正化瘀方药物血清温育，结果发现药物血清抑制库普弗细胞（kupffer cell，KC）培养上清中TGF-b1与PDGF的活性，而且经药物血清作用后的KC培养上清对静止星状细胞的促增殖作用明显减弱[5]。说明扶正化瘀方可通过抑制KC的激活及其旁分泌作用，而抑制星状细胞的活化，从而发挥抗肝纤维化作用。

3）抑制纤维粘连蛋白（fibronectin， FN）/整合素信号途径 肝损害早期FN增加可明显促进HSC活化，而HSC激活后又可生成FN[6]，HSC与胞外基质密切联系。研究发现，扶正化瘀方可明显抑制FN刺激的HSC增殖活化，抑制细胞的整合素蛋白的表达、细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）磷酸化与黏着斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）活性，从而干预整合素的胞内信号转导，干扰FN与HSC的相互联系，抑制FN的促HSC增殖活化，而发挥抗肝纤维化作用。

1.2 保护肝细胞过氧化损伤与凋亡

损伤肝细胞是肝纤维化发生的病理启动因素，防止肝细胞过氧化损伤与肝细胞凋亡是抗肝纤维化的重要环节。CCl4可导致明显的肝脏脂质过氧化损伤与肝纤维化，对于CCl4中毒肝纤维化大鼠，扶正化瘀方明显减轻肝细胞变性坏死、促进肝功能恢复；显著提高肝组织超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性，降低丙二醛含量；且这些作用与降低肝组织羟脯氨酸含量，即抗肝纤维化作用呈相同趋势[7]。并且扶正化瘀方可明显抑制纤维化肝组织ERK1/2磷酸化水平与基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）2/9活性。二甲基亚硝胺（dimethylnitrosamine，DMN）化学中毒也可通过脂质过氧化途径导致肝纤维化[8]，扶正化瘀方对该模型也有良好的抗肝脏脂质过氧化与肝纤维化作用。

体外分离培养正常大鼠肝细胞，经CCl4刺激损伤，同时以扶正化瘀方药物血清温育细胞48 h，结果该含药血清明显促进体外损伤肝细胞的功能恢复。采用脂多糖诱导的肝细胞凋亡小鼠模型与体外诱导肝细胞凋亡模型，扶正化瘀方及其药物血清可明显抑制整体动物与培养肝细胞的凋亡，其作用机制与调节凋亡/抗凋亡因子、抑制半胱氨酸3活性等有关。提示抗肝细胞凋亡是扶正化瘀方抗肝纤维化的重要作用机制之一[9]。

1.3 调节肝脏细胞胞外基质代谢与血管新生

纤维化时，肝脏细胞胞外基质代谢与血管新生密切相关。在肝窦毛细血管化大鼠模型中，肝脏间质性MMP13蛋白表达与活性明显下降，纤溶酶酶原激活剂的抑制物-1（plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1）表达增加，酶活性抑制物金属蛋白酶组织抑制剂（tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP）表达上升；门脉压力升高，肝窦内皮失窗孔与基底膜连续化。扶正化瘀方可明显减少PAI-1与TIMP1、TIMP2蛋白表达，提高MMP13活性水平；降低血清透明质酸水平与减轻内皮细胞损伤，改善肝窦毛细血管化，减轻门脉压力[10]。进一步以具有抗肝纤维化作用的血管新生抑制剂索拉非尼为对照，观察扶正化瘀方对纤维化肝脏血管新生的作用，并围绕血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）/丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路、MMP2/9活性变化、肝星状细胞活化与肝窦内皮细胞去分化等探讨相关作用机制，结果发现，扶正化瘀方与索拉非尼能明显减轻小鼠肝纤维化，同时，血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）与血小板-内皮细胞黏附分子（platelet endothelial cell adhesion molecule-1，PECAM-1/CD31）阳性表达的微血管数量明显减少，该方能够抑制纤维化肝脏的肝窦内皮失窗孔和连续性基底膜形成，提示有抑制肝窦内皮细胞去分化作用。内皮下基底膜降解是血管新生的生化基础，缺氧诱导因子1a（hypoxia inducible factor-1a，HIF-1a）调节的VEGF/MAPK信号通路是其重要分子机制，扶正化瘀方能够抑制肝脏MMP2/9活性，减少HIF-1a表达，抑制VEGF及其受体表达，下调ERK-1/2磷酸化。结果说明扶正化瘀方具有抑制肝纤维化小鼠的肝血管新生作用，该作用是其发挥抗肝纤维化效应的重要原因[11]。

1.4 调节纤维化肝脏差异表达的蛋白质组、mRNAs与miRNAs

以CCl4大鼠肝纤维化模型作为研究对象，对肝纤维化过程中血浆蛋白质组表达的研究发现了10个明显差异表达的蛋白质，其中8个蛋白在肝硬化大鼠血浆中表达减少，扶正化瘀方干预后表达增加，另外2个蛋白则相反，其机制涉及促进蛋白质合成、抗氧化、调控细胞增殖和转化等多方面[12]。在以DMN诱导的大鼠肝纤维化模型肝组织中发现了12个与纤维生成有关的蛋白，其中8个受扶正化瘀调控，与调控新陈代谢和应激反应相关蛋白及肌成纤维细胞活化相关[13]。

采用基因表达谱分析法，对CCl4诱导的大鼠肝纤维化模型发现，扶正化瘀方对肝纤维化组织的差异基因数量为397个，其中上调的有195个，下调的有202个；富集的GO功能共有160条，参与调节的信号通路有17条，主要从调控纤维母细胞、上皮细胞增殖等信号通路改善CCl4诱导的大鼠肝纤维化病变[14]。应用miRNAs芯片分析扶正化瘀对CCl4纤维化小鼠肝脏miRNAs表达谱，筛选出3个扶正化瘀调控的miRNAs；信号通路分析等共得到32条这些miRNAs可能调控的信号通路，其中三磷酸鸟苷（guanosine triphosphate，GTP）酶活性调节、细胞连接、凋亡调节、Ras蛋白信号转导调节及小GTP酶活性调节等与肝纤维化密切相关[15]。

2 扶正化瘀方抗肝纤维化的主要药效物质基础

围绕扶正化瘀方的主要药效药物，曾发现该方剂的几种抗肝纤维化成分，包括桃仁中的苦杏仁苷、丹参中丹酚酸B与虫草菌丝中的虫草组分等。苦杏仁苷可显著抑制肝星状细胞的增殖与胶原生成，与虫草菌丝合用可显著改善血吸虫病患者的肝纤维化病理，苦杏仁苷单用对肝纤维化模型大鼠也有良好的改善作用[16]。其中丹酚酸B可显著改善慢乙肝肝纤维化患者的肝纤维化[17]，可抗肝细胞过氧化损伤、抑制肝星状细胞活化，尤其是调节肝星状细胞内TGF-b1/Smads的信号转导[18]。

扶正化瘀方为口服给药，其有效物质多以血液为介质发挥作用，因而扶正化瘀方中被吸收入血的成分可能是其体内效应物质的关键所在。基于此，我们采用液相谱/电喷雾质谱联用（HPLC/ESI-MS）技术，检测扶正化瘀方口服给药大鼠血清中的药物成分，共鉴定和推断了60多种入血成分[19]。进一步采用多种培养细胞、斑马鱼、与小鼠大鼠模型，评价入血成分的抗肝纤维化活性，发现部分活性成分，包括丹酚酸B、原儿茶醛、咖啡酸、丹参素钠、丹酚酸A、迷迭香酸、隐丹参酮、腺苷、五味子甲素、五味子丙素、五味子酯甲等。采用UHPLC–MS/MS技术，比较扶正化瘀在正常和DMN纤维化大鼠药代动力学及组织分布特点发现，模型大鼠给予扶正化瘀口服后在药代动力学和组织分布中有明显差异。4种扶正化瘀来源的生物活性成分丹参素钠、丹酚酸B和迷迭香酸在模型大鼠中分别升高1.49、3.31和2.37倍；丹参素钠、丹酚酸B、苦杏仁苷主要分布在肺、肾组织，这3种物质在纤维化肝脏中分布明显低于正常大鼠[20]。在此基础上尝试以方剂学君臣佐使理论为指导，结合现代实验技术评价方法，形成了新的组分成分复方，并经DMN肝纤维模型初步验证，该组分复方具有抗肝纤维化疗效[21]。

3 结语

综上所述，扶正化瘀方抗肝纤维化作用机制主要在于抑制肝星状细胞活化；改善肝细胞过氧化损伤与肝细胞凋亡；抑制细胞外基质代谢与抑制肝血管新生等。对该方入血成分通过采用多细胞多模型综合筛选，发现了其效应物质，并从细胞、器官、整体等不同水平进行活性评价，结合中医方剂理论以血管新生为靶点，形成了新的组分复方并初步验证其有效性。这些研究实践表明，坚持中医理论指导，结合传统及临床经验择方用药，按照循证医学的基本要求进行临床试验研究，是探索中医药治疗难治性疾病的有效途径之一。而结合现代生命科学理论与技术，是发现有效中药制剂作用原理与物质基础的重要方法。

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