Balb/c3T3细胞体外转化实验方案的优化①

朱金玲，田　锐，张　虎，张金波，张淑红，金岳雷，扈清云

(佳木斯大学基础医学院，黑龙江佳木斯154007)



Balb/c3T3细胞体外转化实验方案的优化①

朱金玲，田锐，张虎，张金波，张淑红，金岳雷，扈清云

(佳木斯大学基础医学院，黑龙江佳木斯154007)

摘要:目的:优化Balb/c3T3细胞转化实验。方法:将不同浓度的血清及改良的培养基分别作用于鼠成纤维细胞Balb/c3T3，选择不同的时间点，通过细胞形态学观察和集落实验，对小鼠成纤维细胞Balb/c3T3的致癌效果的分析。结果:改良的操作程序和培养基，培养的细胞－细胞转化时间缩短，表现出更强的集落形成能力，显示出高度的成瘤性。结论:改良的操作程序和培养基的方法可缩短实验周期，节省人、财、物力。

关键词:Balb/c3T3细胞;细胞转化;细胞集落实验; ITES

肿瘤已成为严重威胁人类生命与健康的疾病，大多数肿瘤是由环境致癌物引起的。20世纪60年代以来，体外细胞培养技术的发展成熟，人们开始用离体培养细胞对环境污染物进行毒性评价［1，2］。体外检测技术是近年来逐渐发展和成熟起来的一种有效的筛选和检测环境污染物的方法，主要包括染色体畸变试验－微核试验、DNA损伤检测－单细胞凝胶电泳技术(即彗星试验)、体外细胞转化试验等［3］，其中体外哺乳动物细胞转化试验已被国际癌症研究中心、欧洲替代方法研究中心、全国危险化学品管理标准化技术委员会等众多机构评价为一种有效的筛选致癌物的方法［3～6］。体外哺乳动物细胞转化试验是利用动物细胞在体外培养的环境下，模拟致癌物在体内致瘤的作用进行致癌物检测的一种技术。目前唯一直接评价致癌物毒性的体外试验方法是体外细胞转化试验，该方法通过对模型细胞染毒，使正常细胞启动转化后，进入促长阶段，经五周以上的培养，通过显微镜观察细胞形态，计算转化克隆数，改方法实验周期长，转化频率低，实验成本较高。为此，为缩短检测时间，提高环境致癌物的检测效率，降低成本，我们对Balb/c3T3细胞体外转化实验方案进行了优化，现报道如下。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1实验细胞

小鼠胚胎成纤维细胞BALB/3T3 clone A31，购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。

1.1.2主要试剂

DMEM培养基、胎牛血清，Gibco公司;葡萄糖、HEPES，天津市科密欧化学试剂有限公司，N－甲基－N－硝基－N－亚硝基胍(N－me thy－lN－nitro －N－n itrosoguan id ine，MNNG)、佛波酯(12－O －tetradecanoy－l phorbo－l 13－ace tate，TPA)、 DMSO、ITES，Sigma公司;低熔点琼脂糖，Solarbio公司。

1.2方法

1.2.1细胞转化实验

实验分为8组，第1组是TPA处理组:将细胞以1X104/皿接种于直径为6cm平皿中，每个处理组平行接种3皿，37℃，5%CO2湿箱中培养，DMEM培养基血清浓度为10%，培养24h后加入N－甲基－N－硝基－N－亚硝基胍(MNNG) 1μg/mL，4h后换培养基除去MNNG，继续培养7d，于接种后第8天加入浓度为0.1μg /mL的TPA继续培养，每周换液2次，同时补加TPA，第22天除去TPA，第27天甲醇固定细胞，10%的Giemsa染液染色，观察细胞形态及转化灶。第2组是MNNG对照组:用0.2%的DMSO代替TPA，第3组是DMSO对照组:用DMSO代替MNNG和TPA，其他方法同TPA处理组。第4组是正常完全培养基DMEM组:不加任何药品。第5～8组按照1～4组处理，不同的是每组在第8天添加的是改良的DMEM培养基，其含有1%ITES(含胰岛素、转铁蛋白、乙醇胺和亚硒酸钠4种因子)和含2%的胎牛血清，且第14天除去TPA，第19天甲醇固定细胞，10%的Giemsa染液染色，观察细胞形态及转化灶。

1.2.2软琼脂集落实验

对以上8组细胞培养结束时，制成500个活细胞/mL的细胞悬液。取1mL已融化1.2%低熔点琼脂置于6孔板中，作为底层琼脂，然后取0.5mL细胞悬液分别加入已融化0.7%低熔点琼脂0.5mL中混匀。然后移入6孔培养板，置5% CO2培养箱中，37℃进行培养7～10d，利用倒置显微镜进行观察。可见的细胞团(含50个以上细胞)作为计数集落的标准。

1.2.3转化结果判定方法

体外细胞转化试验是以细胞形态恶性转化为检测终点。对转化细胞的判定通常采用细胞灶法，计数克隆数，观察鉴定转化灶，单盲法观察，由2人共同认定。转化灶的判定标准:正常细胞灶，灶内细胞排列规则，束状，细胞灶外围区的细胞单层生长，规则。转化细胞灶，灶内细胞由正常的长梭形变为短梭状，失去接触抑制，呈复层生长，排列紊乱，形成交叉和旋涡。吉姆萨染色恶性转化灶细胞嗜碱深染，致密多层，自由定向生长。

2　结果

2.1细胞转化的形态学及转化灶的吉姆萨染色观察

细胞边缘可见光亮状，细胞排列杂乱无序，周围细胞呈明显的放射状分布;加入含ITES培养基培养后细胞生长速度与未添加组分对比明显升高，且细胞周围接触抑制均无，细胞杂乱无序重叠生长，可见典型的形态转化灶。

图1　上组图为27d各组的细胞形态，下组图为第19天各组的细胞形态

如图1所示，正常转化组与改良培养基转化组比较，ITES组总体转化效率提高，转化时间缩短，且加入ITES的MNNG－TPA组恶性程度极高。

2.2软琼脂集落实验

除MNNG－TPA组外其余组的细胞表现出非恶性及非侵袭性特点，在软琼脂细胞集落形成实验中显示出无或极少数细胞集落形成。而MNNG－TPA组有部分细胞集落出现，而含ITES培养基培养的MNNG－TPA组细胞表现出高于正常培养基培养的MNNG－TPA组细胞的细胞集落形成率。所有含ITES培养基培养的MNNG－TPA组细胞均显示出更强的集落形成能力，显示出高度的成瘤性。

3　讨论

1985年IARC对以BALB c 3T3细胞为基础的细胞转化方法进行了系统的评估，提出了细胞转化实验标准方法，该方法虽能有效检测环境致癌物，但是存在着实验周期长、转化频率低，实验成本较高等不足［8］。为缩短检测时间，提高环境致癌物的检测效率，降低成本，我们对Balb/c3T3细胞体外转化实验方案进行了优化，对操作程序和培养基进行了改进，将培养基加入1%ITES(含胰岛素、转铁蛋白、乙醇胺和亚硒酸钠4种因子)。在各期的形态学观察中我们发现:接种初期细胞死亡比较明显，在第一次加入MNNG后细胞开始出现大量死亡或贴壁不牢固的现象，7d后加入TPA以后细胞开始出现第二次大量死亡，14d后，细胞开始大量增值，死亡数量明显减少。但加入ITES培养后细胞数量MNNGTPA组细胞数量大于不加ITES组，其余均少于不加ITES组。

正常未加入药品的组，细胞贴壁状态好，细胞呈长梭形，胞质清透，死亡率低;加入含ITES培养基培养后细胞生长速度缓慢，细胞贴壁效果不好细胞死亡数量较大。阴性对照DMSO组中，细胞生长受到抑制，生长速度与正常组对比缓慢，且有部分细胞死亡贴壁状态较正常组差，但少部分细胞落中间细胞呈方形，胞质均匀，细胞核略变大，且细胞周围呈圆亮;加入含ITES培养基培养后细胞生长速度、贴壁效果与DMSO组分基本一致，但死亡细胞数量明显增多。MNNG－DMSO组中，细胞生长受到的抑制不明显，细胞贴壁状态较对照DMSO组差，但细胞死亡数量明显减少，大部分细胞集落中间细胞呈方形，胞质不均匀，细胞核变大，且细胞周围呈圆亮。MNNG－TPA组中细胞生长速度最快，细胞团中间细胞间接触抑制消失，胞质浑浊，细胞核变大，常见双核细胞。经染色后观察，正常组细胞、阴性对照DMSO组、阴性对照MNNG－DMSO组，细胞均存在接触抑制，细胞生长呈长梭形，细胞单层生长，胞浆

和核染色较浅。而MNNG－TPA组细胞接触抑制现象消失，细胞呈不规则形状，细胞多层重叠生长，胞浆淡染，细胞核深染，且细胞呈侵袭生长。转化灶呈放射状生长，边缘不整齐，符合Ⅲ型转化灶的特征［7］。

结果显示ITES可使转化频率提高，同时转化灶出现时间提前，同时我们调整降低DMEM培养基中的胎牛血清(FCS)浓度，最低调整到2%，实验结果与传统采用10%FCS的DMEM培养的方法相比，调整后的方法可将转化实验周期缩短至3周，且较低的血清浓度可以降低血清批次差别对转化实验重现性的影响。结果表明使用DMEM + 2% FCS + 1% ITES培养的效果最好，实用可行，节省了人、财、力。后续我们将用该方法检测毒物验证其效果。

参考文献:

［1］Dimitrov S D，Mekenyan O G，Sinks G D，et al.Global modeling of narcotic chemicals: ciliate and fish toxicity［J］.Journal of Molecular Structure: Theochem，2003，622(1－2) : 63－70

［2］李磊，杨雨晗，王双，等.细胞活性检测方法之比较［J］.生物学杂志，2011，28(1) : 87－93

［3］BOLEY S E，MCMANUS T P，MAHER V M，et al.Malignant transformation of human fibroblast cell strain MSU－1 1 by NMethyl－N－nitrosourea: Evidence of eliminationof p53 by homologous recombination［J］.Cancer Res，2000，60(15) : 4105－4111

［4］Vanparys P，Corvi R，Aardema M，et al.ECVAM prevalidation of three cell transformation assays［J］.Altex，2010，28: 56－59

［5］Sakai A，Sasaki K，Hayashi K，et al.An international validation study of a Bhas 42 cell transformation assay for the prediction of chemical carcinogenicity［J］.Mutat Res，2011，725(1－2) : 57

［6］Stuart Creton，Marilyn J，Aardema1，et al.Cell transformation assays for prediction of carcinogenic potential: state of thescience and future research needs［J］.Mutagenesis，2012，27: 93－101

［7］Tsuchiyat，Umedam.Improvement in the efficiency of the in vitro transformation assay method using BALB 3T3 A31－1－1 cells［J］.Carcinogensis，1995，16(8) : 1887－1894

［8］张磊，曾毅.Balb/c3T3细胞体外转化实验及其在环境致癌物检测上的应用［J］.卫生研究，2009，38(2) : 226－231

(收稿日期:2015－12－18)

通讯作者:扈清云(1967～)男，黑龙江绥化人，硕士，教授，硕士研究生导师。E－mail: 370786436@ qq.com。

作者简介:朱金玲(1967～)女，黑龙江佳木斯人，硕士，教授，硕士研究生导师。

基金项目:①1.黑龙江省自然科学基金资助，编号: H201369; 2.佳木斯大学科学技术研究重点项目，编号: Sz2013－001。

中图分类号:R979.1

文献标识码:A

文章编号:1008－0104(2016) 02－0001－02