肝纤维化无创诊断的研究现状

田华捷+冯琴+胡义扬

摘 要 肝纤维化的无创诊断对慢性肝病的进展、预后和治疗疗效的评估具有重要意义。本文系统回顾和分析总结近20年来肝纤维化无创诊断的研究进展，包括血清学检测及其数学模型、影像学检查、血清分子生物学新检测技术等诊断方法在肝纤维化无创诊断中的临床应用价值和局限性，并提出基于系统生物学的生物标志物的筛选和超声波肝脏弹性检测方法的优化可能是今后的重要研究方向。

关键词 肝纤维化 无创诊断 影像学 血清学标志物 基因组学

中图分类号：R575.2 文献标识码：A 文章编号：1006-1533（2016）13-0024-05

Research status of non-invasive diagnosis of liver fibrosis*

TIAN Huajie1**， FENG Qin1， HU Yiyang1，2***（1. Shuguang Hospital & Institute of Hepatology， Shanghai University of Traditional Chinese Medicine， Shanghai 201203， China；

2. Key Laboratory of Liver and Kidney Diseases， Ministry of Education， Shanghai 201203， China）

ABSTRACT Non-invasive diagnosis of liver fibrosis plays an important role in the progression， prognosis and curative effect evaluation of chronic liver disease. In this paper， the research progress of liver fibrosis non-invasive diagnosis in recent 20 years was systematically reviewed and summarized， including clinical application value and limitations of serum marker， serologic diagnostic models， serum molecular biology technology and imaging examination. It was suggested that the screening of biomarkers based on systems biology and the optimization of ultrasonic liver elasticity imaging detection would be an important research direction in the future.

KEY WORDS liver fibrosis； non-invasive diagnosis； imaging； serum biomarkers； genomics

肝纤维化是病毒性肝炎、非酒精性脂肪性肝炎、酒精性肝病、自身免疫性肝病和胆汁淤积性肝病等各种慢性肝病共有的病理过程[1]，主要特征在于肝窦内的肝星状细胞活化及细胞外基质的过度沉积[2]。现已明确，肝纤维化是可逆的。目前，肝纤维化诊断的“金”方法仍然是肝穿刺后的组织学检查。由于肝组织的活组织检查术是创伤性检查，存在不易被患者接受、有潜在风险、取样局限性可能影响肝纤维化程度评估的准确性（可能存在25%的差异[3]）和难以动态监测肝纤维化程度的变化及治疗效果等问题，因此寻找低成本、低风险、高效率的肝纤维化无创评估与诊断方法一直是肝纤维化研究领域中的热点[4-5]，而其对了解疾病的进展、预后和治疗疗效的评估具有重要的临床意义。

目前，肝纤维化的无创诊断方法主要包括血清学检测及其数学模型、影像学检查、血清分子生物学新检测技术等诊断方法。近年来，以综合多项临床、生化指标为基础的肝纤维化无创诊断模型和通过检测肝脏硬度值（liver stiffness）来反映肝纤维化程度的瞬时弹性成像术（transient elastography， TE）受到广大专家学者的关注和认可。此外，随着宏观基因组学在生物医学研究领域中的应用，一部分专家学者也在致力于寻找能够灵敏、准确地反映肝纤维化程度的新的血清学诊断标志物，并取得了一定的进展。

1 血清学诊断

血清学诊断标志物主要分为间接和直接标志物两大类。间接标志物是指可反映肝损伤及炎症程度的相关指标，包括血小板、丙氨酸转氨酶（alanine aminotransferase， ALT）、天冬氨酸转氨酶（aspartate aminotransferase， AST）、α2-巨球蛋白、γ-谷氨酰转肽酶（γ-glutamyl transpeptidase， GGT）、总胆红素和载脂蛋白A1等，它们的水平变化能反映肝功能的变化，但无法准确地反映肝纤维化的程度。直接标志物是指可反映肝组织细胞外基质变化以及与细胞外基质转化、纤维化形成和分解有关的物质，如透明质酸、Ⅲ型前胶原氨基末端肽（procollagen type III amino-terminal peptide， PIIINP）、Ⅰ型和Ⅳ型胶原、层粘连蛋白、基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase， MMP）、金属蛋白酶组织抑制剂（tissue inhibitor of metalloproteinase， TIMP）、转化生长因子β1等。其中，透明质酸为细胞外基质中最重要的糖胺多糖成分，其水平可较准确、灵敏地反映肝内已生成的纤维量及肝细胞的受损、炎症活动状况，且对不同原因引起的肝纤维化均有很好的诊断价值[6]；层粘连蛋白为基底膜中特有的非胶原性糖蛋白，其水平与肝纤维化活动程度和门静脉压力均呈正相关性，但用来判断肝纤维化程度尚不够灵敏，只能用来判断肝纤维化活动程度。Li等[7]在87例慢性乙型肝炎患者中比较了血清透明质酸和层粘连蛋白水平对肝纤维化的诊断价值，结果发现使用血清透明质酸水平诊断肝纤维化的敏感性、特异性、阳性诊断率和阴性诊断率分别为84.2%、83.3%、90.6%和73.5%，而使用血清层粘连蛋白水平诊断肝纤维化的敏感性、特异性、阳性诊断率和阴性诊断率分别为71.9%、80.0%、87.2%和60.0%。血清PIIINP水平反映了肝脏胶原的合成、代谢状况，可用来动态监测肝纤维化的活动性；血清Ⅳ型胶原的水平变化可较灵敏地反映肝纤维化过程，故是肝纤维化早期的诊断标志物之一。此外，肝细胞膜分泌的一类具有调节基质降解作用的蛋白（MMP、TIMP等）与肝纤维化的发生和细胞外基质降解密切相关，其水平也可用来评估肝纤维化程度[8-11]。Boeker等[12]研究发现，使用血清TIMP-1水平预测早期肝硬化的敏感性达100%，特异性为56% ～ 75%。但总体而言，对肝纤维化诊断，使用单一血清标志物的敏感性和特异性较低，且往往还易受到诸多其他因素如肝脏炎症、肝脏代谢或清除能力下降等的影响，诊断价值有限，仅仅只能用作参考[13]。

2 血清学诊断的数学模型

为了提高肝纤维化血清学无创诊断的效率，近年来国内外学者建立了多种基于多项血清学指标的诊断模型。这些模型一般可分为两类，其中一类是以临床常规检查指标为参数构成的简单模型，包括AAR（AST与ALT水平的比值）、APRI（ALT与血小板水平的比值指数）、FIB-4指数和Forns指数等。AAR≥1对肝硬化诊断的敏感性为53%，特异性为100%，受试者工作特征曲线下面积（area under the receiver operating characteristic curve， AUC）为0.57，阳性和阴性预测值分别为100%和80.7%[14]。与AAR相比，APRI可更简单、准确地预测重度肝纤维化和肝硬化，但是无法区分患者肝纤维化程度的不同。Lin等[15]对40项合计包括8 739例慢性丙型肝炎患者的研究数据的meta分析显示，当肝纤维化分期≥2和3期时，使用APRI诊断的AUC分别为0.77和0.80，敏感性分别为77%和72%，特异性分别为61%和64%。FIB-4指数由年龄、血小板计数、AST和ALT构成。Amorim等[16]分析了FIB-4指数和APRI对慢性丙型肝炎患者肝纤维化诊断的AUC，发现分别为（0.811±0.045）和（0.793±0.047）。Forns指数由年龄、GGT、胆固醇和血小板计数构成，诊断慢性丙型肝炎患者肝纤维化的敏感性和特异性分别为94%和81%，AUC为（0.853±0.017）[17]。但因Forns指数用到的指标胆固醇其水平受到慢性丙型肝炎基因型的影响，故该模型具有局限性，尤其是用于亚洲患者时。

另一类诊断模型是包含了肝纤维化血清学指标的模型，包括Fibrotest、FibroSpect II、FibroMeter、Hepascore、上海肝纤维化组（Shanghai Liver Fibrosis Group， SLFG）模型和FibroIndex等。Fibrotest由GGT、α2-巨球蛋白、总胆红素、肝珠蛋白-2和载脂蛋白A1构成，但需根据患者年龄和性别进行调整。Poynard等[18]的meta分析显示，Fibrotest对慢性乙型肝炎患者进展期肝纤维化诊断的AUC为0.84，再次验证了Fibrotest对肝纤维化的诊断价值[19]。不过，在临床实践中，Fibrotest易受急性炎症因素的影响，导致因α2-巨球蛋白和肝珠蛋白-2水平升高而出现假阳性或者假阴性[20]。FibroSpect II由透明质酸、TIMP-1和α2-巨球蛋白构成，诊断慢性丙型肝炎患者肝纤维化的AUC为0.831，敏感性和特异性分别为83%和66%，阳性和阴性诊断率分别为74.3%和75.8%，总准确率为75%[21]。FibroMeter由血小板计数、凝血酶原指数、AST、α2-巨球蛋白、透明质酸、尿素氮和年龄构成，诊断慢性乙型肝炎相关的显著性肝纤维化、晚期肝纤维化和肝硬化的能力较强，AUC分别为0.778 ～ 0.85、0.876 ～ 0.94和0.836[22-23]。Hepascore由胆红素、透明质酸、α2-巨球蛋白、GGT、年龄和性别构成，是专为慢性丙型肝炎患者建立的诊断模型，在建模组中诊断显著性肝纤维化、晚期肝纤维化和肝硬化的AUC分别为0.85、0.96和0.94，在验证组中诊断显著性肝纤维化、晚期肝纤维化和肝硬化的AUC分别为0.82、0.90和0.89；在Hepascore≥0.5时诊断显著性肝纤维化的敏感性为95%、特异性为92%，在Hepascore≥0.84时诊断肝硬化的敏感性为71%、特异性为84%[24]。SLFG模型由上海肝纤维化组建立，由α2-巨球蛋白、年龄、GGT和透明质酸构成，在建模组和验证组中诊断肝纤维化的AUC分别为0.84和0.77[25]。FibroIndex由年龄、血小板计数、GGT和透明质酸构成，判断不同分期肝纤维化的AUC均在0.88左右。根据3个界值2.2、3.0和5.4分别设定不同程度肝纤维化的排除标准，使用FibroIndex可筛选出81%的无肝纤维化患者而使他们避免肝活组织检查术，并使75%以上的无重度肝纤维化或早期肝硬化患者得到鉴别，且后2个界值的阴性预测率高达90%以上[26]。

由于疾病谱的差异，国际上各种肝纤维化无创诊断模型绝大多数是在慢性丙型肝炎、其次是在酒精性肝病患者中建立并进行验证的，而我国的慢性肝病以慢性乙型肝炎为主，故这些模型是否适用于我国慢性乙型肝炎患者，还是我国建立的诊断模型更符合国情，抑或是多模型综合运用的诊断准确性更高，尚待进一步的研究。此外，虽然这些诊断模型有的已在辨别无或轻度肝纤维化以及早期肝硬化方面成功地发挥了作用，但它们对中度肝纤维化的判断能力仍有待提高。值得一提的是，联合运用2 ～ 3种诊断模型可有效地提高诊断的准确性。总体而言，血清学无创诊断模型具有如下优点：无创性，能全面反映患者的整体状况并减少脂肪、体重和腹水等因素的干扰；易于反复使用，便于在治疗过程中对患者的复查和随访；与肝活组织检查术相比，在风险和费用方面均更易被患者接受。但随着国内外研究的深入，血清学无创诊断模型的缺点也逐渐显现，包括对这些模型的使用尚缺乏统一的选用标准和评估标准、诊断的可靠性尚不明确和计算比较繁琐等。

3 影像学诊断

肝纤维化的影像学诊断因具有无创或微创、高效等特点，一直是临床上的重要方法和手段之一，常用手段包括超声波、计算机断层扫描（computed tomography， CT）和磁共振成像（magnetic resonance imaging， MRI）检查等，对肝纤维化的诊断依据均为肝脏形态学的改变。研究发现，B超检查对肝硬化诊断的准确率约为80%，但用于轻、中度肝纤维化诊断不敏感[27]。CT和MRI检查在诊断肝脏弥漫性病变上的价值远不如诊断肝内占位性病变，不敏感且缺乏特异性[28]，同时费用高，故不推荐用作肝纤维化或肝硬化的常规检查手段。近年发展起来的TE、声辐射力脉冲成像（acoustic radiation force impulse， ARFI）和磁共振弹性成像（magnetic resonance elastography， MRE）技术因操作简便、重复性好且具有较高的敏感性和特异性，已显示具有较高的肝纤维化诊断价值。

Fibroscan是最早用于临床的一种TE技术，检测慢性肝炎患者的肝脏硬度值和评估肝纤维化进展的有效性已得到临床实践的证实，且为各国相关临床指南所推荐。Afdhal等[29]在美国748例慢性丙型肝炎或慢性乙型肝炎患者中比较了Fibroscan和肝活组织检查术诊断肝纤维化的准确性，结果显示Fibroscan的诊断准确性更高。Seo等[30]在韩国慢性病毒性肝炎患者中的研究亦得到了相同的结论。但Fibroscan也有局限性：一方面，Fibroscan的检测结果往往受到操作者主观感受的影响，因此需由经验丰富的工作人员来操作，且检测结果的阐释也需结合患者的临床资料和其他影像学、内镜和生化检查结果作综合分析；另一方面，Fibroscan的检测成功率受到患者肥胖和肋间隙大小等因素的影响，检测值又受到肝脏脂肪变、炎性坏死和胆汁淤积的影响，且不易准确区分相邻分期的肝纤维化[31]。近期，国内发展的相似技术FibroTouch也已开始用于临床，并取得了较满意的效果。袁利超等[32]在75例慢性乙型肝炎患者中比较了FibroTouch与Fibroscan的肝纤维化评估效果，结果发现两组患者的肝脏硬度值分别为（7.8±5.7）和（8.0±5.8）kPa，但配对t检验显示差异无统计学意义（t=-0.17， P=0.861 6）。

不同于TE技术，ARFI技术运用了二维超声波成像技术，而该技术可嵌入常规超声波扫描仪中，从而实现对肝实质的检测，并具有可任意选点、多点和多次取样，适用于弥漫性、不均匀性和局灶性病变，以及有多普勒、声学造影和穿刺功能的特点。MRE技术可直观显示通过肝组织的剪切声波，可用于定量检测和评估整个肝脏，避免取样误差，有望成为肝纤维化无创诊断的新“金标准”。Batheja等[33]的研究显示，MRE技术用于检测和评估肝纤维化是可行和有效的，特别是用于鉴别F0 ～ F2和F3 ～ F4级肝纤维化。不过，尽管已有这些可喜的进展，但仍有许多问题需要解决，如上述无创诊断方法的诊断效力、肝纤维化分级的界点和阈值、诊断成本、推广使用的可行性等。

4 血清分子生物学新诊断技术

近10年来，随着第二代功能测序技术的发展，基因组学和蛋白组学、尤其是微小RNA（microRNA， miRNA）在肝纤维化动态评估中的作用越来越重要。miRNA是以序列特异性方式调控基因表达的一类非编码蛋白的单链小分子RNA，在肝脏疾病患者中呈差异性表达，提示miRNA可能参与调控着肝脏疾病的发生、发展和转归。Venugopal等[34]采用胆管结扎法建立大鼠肝纤维化模型，使用mirVana miRNA分离试剂盒从其肝星状细胞中分离得到包括miRNA在内的总RNA，纯化后再进行miRNA水平谱分析，结果发现模型大鼠肝星状细胞中的miR-150和miR-194水平下降，而它们水平升高可使α-平滑肌肌动蛋白和Ⅰ型胶原表达下降，故推测这2个miRNA可用作肝纤维化诊断及治疗疗效评估的标志物。Guo等[35]的研究发现，在肝星状细胞活化过程中有12个miRNA水平升高、9个miRNA水平降低；miR-15b和miR-16可直接诱导肝星状细胞凋亡。Murakami等[36]采用给小鼠腹腔灌注四氯化碳建立肝纤维化模型，然后分别取4、6和8周后的模型小鼠肝组织进行miRNA水平谱分析，结果发现miR-199a、miR-200a和miR-200b水平与肝纤维化分期呈一致性改变，而它们水平升高则可使肝星状细胞中的纤维化相关基因表达显著增加，由此推测这些miRNA可用作肝纤维化诊断及治疗疗效评估的标志物。

有关miRNA的研究虽已取得了一定的进展，为早期肝纤维化的无创诊断提供了新的途径，但miRNA水平存在较大的人群、人种差异并与生活环境和遗传因素等有关，因此离临床应用还有相当的距离。

5 展望

理想的肝纤维化诊断方法应具备无创性、高度的准确性和敏感性，以及肝脏特异性、易于检测和能实时监测疾病的变化等特性。肝纤维化无创诊断方法的研究已在过去数十年中取得了一定的进展，其中以血清学指标为基础建立的无创诊断模型以Fibroscan为代表，其在肝纤维化诊断上具有较高的实用价值。不过，因诊断结果在肝纤维化分期上缺乏精准性，故目前无法完全替代肝活组织检查术。肝纤维化无创诊断方法的今后研究方向将会聚焦在已有无创诊断模型的优化以及开发新的血清学和影像学无创诊断方法方面，尤其是基于系统生物学的生物标志物的筛选和超声波肝脏弹性检测方法的优化可能是今后的重要研究方向。我们相信，在不久的将来，肝纤维化无创诊断方法的准确性和特异性必能得到进一步的提高，从而对慢性肝病相关肝纤维化的防治产生积极的影响。

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