恩替卡韦联合逍遥散对肝纤维化肿瘤坏死因子TNF-α的影响①

王庆生，李绍民，冯　澜

(佳木斯大学附属第一医院 传染病科，黑龙江 佳木斯 154003)



恩替卡韦联合逍遥散对肝纤维化肿瘤坏死因子TNF-α的影响①

王庆生，李绍民，冯澜

(佳木斯大学附属第一医院 传染病科，黑龙江 佳木斯 154003)

摘要：目的：采用硫代乙酰胺(TAA)诱导的大鼠肝纤维化模型进行实验研究，观察恩替卡韦联合逍遥散抗肝纤维化作用，对该方抗肝纤维化的可能作用机理进行研究。方法：SD雄性大鼠30只，随机分为肝纤维化模型组、恩替卡韦治疗组和恩替卡韦联合逍遥散治疗组。为大鼠皮下注射TAA，每周注射2次，连续注射至第6周，形成肝纤维化。药物治疗组于造模第7周开始，每天给予逍遥散水煎液8g/kg灌胃，每周恩替卡韦0.5mg/kg灌胃，6周后用腹腔注射麻醉大鼠后从眼球静脉丛取血收集血清。对模型组和治疗组的生化指标ALT和AST进行检测，利用放免试剂盒进行酶联免疫吸附试验(ELISA法) 检测血清中TNF-α。结果：与模型组相比，治疗组显著降低了血清AST/ALT的活性，TNF-α浓度有明显降低。结论：恩替卡韦联合逍遥散可有效抑制促肝纤维化细胞因子TNF-α的表达，其机制可能与恩替卡韦联合逍遥散阻断纤维化形成过程中细胞因子的网络传递有关。

关键词：恩替卡韦联合逍遥散；肝纤维化；肿瘤坏死因子TNF-α；硫代乙酰胺

肝纤维化是对各种慢性刺激的愈合反应，包括乙型肝炎病毒感染、代谢紊乱、酗酒和自身免疫性对肝脏的攻击。肝纤维化是肝硬化的前兆，是所有慢性肝病向肝硬化发展的重要病理进程，肝纤维化和肝硬化的产生和发展是多种类型的细胞、细胞因子和核糖核酸参与的结果。活化肝星状细胞(HSC)是肝纤维化的发生发展中的关键事件和胶原沉积的一个主要因素。HSC活化的特点是细胞增殖和迁移，收缩后转化成肌成纤维细胞，生成大量胶原蛋白和其他细胞外基质(ECM)，最终导致肝纤维化。在分子水平上，多种细胞因子参与调解HSC的活化和纤维化形成的信号通路调节。在抑制HBV复制以罕见的耐药突变和它的安全在慢性肝炎和肝硬化患者，恩替卡韦治疗实践的研究证实了其有效性。恩替卡韦作为一种强效的抗病毒药物在慢性病毒性肝炎的治疗中应用广泛，其抗病毒活性较其他核苷类似物强许多倍，且具有更好的抑制病能力，而长期应用并不会产生明显的耐药性，尤其适合肝纤维化的抗病毒治疗。一系列的中药抗肝纤维化的实验研究也相继展开[1~2]，逍遥散为经典古方，治疗慢性乙型肝炎中医理论明确，验之临床疗效显著，同时临床上广泛用于肝纤维的防治。目前中西药物联合应用的作用机制不清楚，本文试图在恩替卡韦功效和现代临床应用经验的基础上，联合逍遥散，对采用硫代乙酰胺(TAA)诱导的大鼠肝纤维化模型进行实验研究，观察恩替卡韦联合逍遥散抗肝纤维化作用，并初步探讨其作用机制，为临床应用恩替卡韦联合逍遥散中西医结合治疗肝纤维化提供更多的科学依据。

1材料与方法

1.1材料与试剂

实验动物：清洁级SD雄性大鼠30只(由佳木斯大学实验动物中心提供)，体质量(220~250)g。

主要实验试剂：丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(AST)试剂盒，购自南京建成生物工程研究所，肿瘤坏死因子α(TNF-α)ELISA试剂盒，购自上海森雄科技实业有限公司。TAA购自天津市大茂化学试剂厂，逍遥散处方饮片(购自北京同仁堂制药集团哈尔滨药店)制成逍遥散水煎液，浓度为2g/mL，为生药量，恩替卡韦片剂(中美上海施贵宝公司)。

1.2动物模型制备与分组给药

SD雄性大鼠30只，把大鼠随机分为3组，每组各10只，即空白对照组、模型组恩替卡韦联合逍遥散治疗组。空白对照组在常温下自由摄取食物和饮水，适应性饲养7d后进行实验。其余两组大鼠皮下注射浓度为0.03%的TAA生理盐水溶液 200 mg/kg，每周注射2次，连续注射至第6周，形成肝纤维化，6周造模给药结束后，提取血清，并于-40℃中保存。药物治疗组于造模第7周开始，每天给予逍遥散水煎液8g/kg灌胃，每周恩替卡韦0.5mg/kg灌胃，6周治疗结束后，提取血清以备检测。

1.3观察指标

1.3.1临床生化指标检测

对大鼠进行眼眶静脉丛取血，采集模型组和治疗组大鼠的血清，分离血清，按照试剂盒的说明对ALT和AST进行浓度测试。

1.3.2细胞因子的检测

采集模型组和治疗组大鼠的血清，利用放免试剂盒进行酶联免疫吸附试验(ELISA法)，严格按照试剂盒所示方法检测所提取的大鼠血清中的TNF-α含量。

1.4统计学方法

2结果

2.1一般情况

造模期间大鼠体质量的增加明显慢于实验前。正常对照组肝脏无任何病理异常，具有明显的肝细胞的板块，窦状小管和中央静脉，肝细胞多边形有保存完好的胞质明显的细胞核。造模完成后，TAA模型组显示肝僵硬、肿胀与粗糙，表面上有颗粒状或结节状改变，类似于人类的严重肝纤维化，表现出正常结构的损失，炎症和阻塞与细胞质空泡化的迹象，脂肪变化，血窦扩张。与TAA对照组相比，治疗组表现出更少纤维结节，尤其恩替卡韦联合逍遥散联合治疗组的肝脏显示平滑的表面和不结节状改变，正常的肝结构，最小肝细胞结构的破坏，保存完好的胞浆，很小的纤维化胶原隔膜和低淋巴细胞浸润。这些观察的改变都表明恩替卡韦联合逍遥散联合治疗的有效性。

2.2模型组和治疗组大鼠ALT，AST含量

模型组与治疗组血清中ALT和AST含量变化，见表1。TAA模型组显著上调了血清AST/ALT，而治疗组显著降低了血清AST/ALT的活性。

表1　大鼠血清ALT和AST含量变化

注：与空白对照组比较，*P<0. 05；与模型组比较，**P < 0. 05。

2.3模型组和治疗组大鼠肝组织中TNF-α浓度变化

模型组与治疗组大鼠肝组织中TNF-α浓度变化,见表2。与模型组比较，治疗组中TNF-α含量显著降低。

表2　大鼠血清TNF-α浓度变化

注：与空白对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，**P<0.05。

3讨论

肝脏是代谢和解毒的重要器官，肝纤维化以细胞外基质(ECM)过度沉积为特点，是由于生物因素或化学药物对慢性或反复性肝损伤的一种创伤愈合反应[3]。肝纤维化导致一系列的慢性炎症性疾病，包括病毒性肝炎、酒精饮料和非酒精性脂肪性肝炎免疫损伤、原发性胆汁性肝硬化等[4]。慢性炎症后胶原蛋白逐渐积累，它包括肝细胞和循环免疫细胞产生细胞因子的驱动。由于这些炎症刺激，狄氏间隙中的静态星状细胞激活类肌成纤维细胞分泌胶原蛋白。胶原蛋白和其他细胞外基质分子的积累远远超过从驻留和巨噬细胞浸润释放金属蛋白酶降解。持续的伤害，无论是门户域或中央静脉周围纤维化的发展最初，最终形成桥接纤维化结节形成厚厚的纤维组织带包围，最终导致肝硬化。扭曲的结构肝硬化门静脉高压症导致并发症、减少肝细胞功能和肝癌的风险。因此，肝纤维化早期诊断和预防可以有效地防止肝硬化及其并发症。尽管现代医学取得了巨大进展，但还没有满意的治疗方法或治疗肝病药物[5]。因此，开发新的药物保护作用已变得更为重要和紧迫[6]。

在我们的实验中，与恩替卡韦联合逍遥散治疗组相比，TAA模型组有显著的减少体重与肝、脾重量显著增加，这可以归因于在整个实验期间TAA的毒性效应。这被认为是最可靠和一致的症状在实验动物中的毒性。治疗组大鼠的体重正常的增加表明了其安全性。治疗组中，肝脏切片相对轻微的发炎和轻微空泡变性，而大部分区域无明显变化。组织病理学检查也表明了TAA所致纤维恢复良好。TAA大鼠肝脏显示脂肪变性、坏死，治疗组有显著减少纤维化的程度，这可能是由于减少大鼠星状细胞浸润。TAA介导的肝纤维化模型是一种非常有效、可靠和令人满意的实验肝损伤模型[7]。TAA介导的肝纤维化是造成自由基介导的脂质过氧化作用。在慢性TAA中毒过程中，大量肝纤维化和突出的再生结节发展为相关的肝硬化门脉高压症和高动力循环特性。这一点体现在其组织病理学分析和生化参数(ALT、AST等)上。AST/ALT是细胞中的转氨酶，这是常规肝损伤的敏感指标[8]。增加的AST/ALT水平表明肝细胞中的一种炎症状态，它可能导致肝纤维化[9]。TAA干扰RNA从细胞核与细胞质的运动，造成膜损伤，结果了增加肝脏血清标志物的释放。在我们的实验中，TAA模型组显著上调了血清AST/ALT，而治疗组显著降低了血清AST/ALT的活性。治疗组生化指标水平的明显改善，表明恩替卡韦联合逍遥散对保护肝脏起到了有益的影响。

在分子水平上，多种细胞因子参与调解的信号通路调节HSC的活化和纤维化形成。细胞因子及氧化应激被认为是导致纤维化，结果导致星状细胞的激活。TNF-α主要是由单核细胞、巨噬细胞，肝星状细胞和、Kupffer细胞产生。它对这些细胞有促炎症反应活动和毒效应。肝纤维化的过程中，肿瘤坏死因子-α在HSC的活化和细胞外基质ECM的合成中起重要作用。通过上调抗凋亡因子NF-кB，Bcl-XL和p21，以及下调凋亡信号因子P53，TNF-α可以减少自发性激活大鼠HSC的凋亡。然而，肿瘤坏死因子α对HSCs和纤维化的影响是复杂的。在NASH动物模型中，肿瘤坏死因子-α信号通过激活KCs肝纤维化发病机制中起着至关重要的作用[10]。与模型组比较，治疗组中TNF-α含量显著降低，提示恩替卡韦联合逍遥散对肝纤维化具有显著地预防和治疗作用，其机制可能与减少TNF-α的释放，抑制HSC的活化，在转录和翻译水平干预HSC中基因的表达有关。实验获得的所有数据表现出较强的初步证据，恩替卡韦联合逍遥散对TAA诱导的肝纤维化具有保护作用，因此，可作为有效的中西医结合方法对化学性肝损伤起到有效的预防和治疗作用。

参考文献:

[1]刘成海, 慕永平, 刘平. 肝纤维化中西医结合治疗进展与发展方向[J]. 中华消化病与影像杂志 (电子版), 2014 ,4(6):1-4

[2]卓越, 张天英, 龙鑫. 扶正化瘀胶囊对大鼠肝纤维化转化生长因子 1表达的影响[J]. 黑龙江医药科学, 2014,37(6):69-70

[3]Williams R. Global challenges in liver disease[J]. Hepatology, 2006, 44(3): 521-526

[4]Hernandez-Gea V, Friedman S L. Pathogenesis of liver fibrosis[J]. Annual review of pathology: mechanisms of disease, 2011, 6:425-456

[5]Jhade D, Ahirwar D, Jain R, et al. A pharmacological review: Amaranthus spinosus[J]. Research Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry, 2009, 1(3): 169-172

[6]Achliya G S, Wadodkar S G, Dorle A K. Evaluation of hepatoprotective effect of Amalkadi Ghrita against carbon tetrachloride-induced hepatic damage in rats[J].Journal of Ethnopharmacology, 2004, 90(2):229-232

[7]Müller A, Machnik F, Zimmermann T, et al. Thioacetamide-induced cirrhosis-like liver lesions in rats usefulness and reliability of this animal model[J]. Experimental pathology, 1988, 34(4): 229-236

[8]Achliya G S, Wadodkar S G, Dorle A K. Evaluation of hepatoprotective effect of Amalkadi Ghrita against carbon tetrachloride-induced hepatic damage in rats[J]. Journal of Ethnopharmacology, 2004, 90(2):229-232

[9]Li D, Friedman S. Liver fibrogenesis and the role of hepatic stellate cells: new insights and prospects for therapy[J].Journal of gastroenterology and hepatology, 1999, 14(7):618-633

[10]Zhou W C, Zhang Q B, Qiao L. Pathogenesis of liver cirrhosis[J]. World Journal of Gastroenterology WJG, 2014, 20(23):7312

The effect of entecavir combined with xiaoyao powder on tumor necrosis factor TNF-α with hepatic fibrosis in rat

WANGQing-sheng,LIShao-min,FENGLan

(The Department of Infectious Diseases, the First Affilliated Hospital of Jiamusi University, Jiamusi 154003, China)

Abstract:Objective: To investigate the antifibrotic effect of entecavir combined with Xiaoyao power on thioacetamide (TAA)-induced rat hepatic fibrosis. Methods: The 30 rats were randomly divided into three groups: nomal control group, model group and treated group. Thioacetamide (TAA) (300 mg/kg body weight) was injected intraperitoneally 2 times a week into model group and treated group for 6 weeks to form liver fibrosis. Group3 were treated with entecavir (0.5mg/kg) combined with Xiaoyao power (8g/kg) by gastric perfusion for six weeks. The changes of plasma biochemistry and TNF-α were measured with the methods of biochemistry and ELISA. Results: The treatment with entecavir combined with Xiaoyao power restored the biochemical parameters (ALT/AST) towards normal. The level of TNF-α was significantly lower in the treated group compared to the model group. Conclusion: Entecavir was combined with Xiaoyao powder which can effectively inhibit the expression of hepatic fibrosis-promoting cytokines TNF-α. Entecavir combined with Xiaoyao may be block the network transmission of cytokines in the formation of fibrosis.

Key words:entecavir combined with xiaoyao power; hepatic fibrosis; tumor necrosis factor TNF-α; thioacetamide (TAA)

(收稿日期：2015-05-10)

中图分类号：R575.2

文献标识码：B

文章编号：1008-0104(2016)01-0084-02

作者简介:王庆生(1970～)男,黑龙江哈尔滨人,在读硕士研究生。通讯作者:李绍民(1967～)男,黑龙江佳木斯人,学士，主任医师,教授,硕士研究生导师。E-mail: hwwqs216@ 126. com。