BRAF基因突变与结直肠腺癌病理及临床预后的意义①

伍　洁，柳风序 ，李雪欣，姚海涛

(1.牡丹江市第二人民医院，黑龙江 牡丹江 157013；2．佳木斯大学，黑龙江 佳木斯 154007)



BRAF基因突变与结直肠腺癌病理及临床预后的意义①

伍洁1，柳风序2，李雪欣2，姚海涛2

(1.牡丹江市第二人民医院，黑龙江 牡丹江 157013；2．佳木斯大学，黑龙江 佳木斯 154007)

摘要：目的:BRAF基因突变对结直肠腺癌病理及临床治疗的意义。方法:收集我院 2014年1~12月经病理科诊断手术的166例原发结直肠腺癌组织标本及61例癌旁正常组织。用PCR-DNA直接测序法检测BRAF突变情况。结果:①癌组织中BRAF基因突变率9.04%，常见类型BRAF-V600E，癌旁正常组织无基因突变。②癌组织分级低突变率较组织分级高的患者突变率高，癌组织有淋巴转移患者BRAF基因突变率较无转移患者的高，两者差异有统计学意义(P<0.05)。③癌组织BRAF基因突变率与患者性别、年龄、发病部位无相关性(P>0.05)。有远处转移的患者BRAF基因突变率比无远处转移的明显增高，但差异无统计学意义(P>0.05)。结论:结直肠癌患者中，癌组织BRAF基因突变率明显高于旁正常组织，与癌组织的分化程度、淋巴转移有相关性，有器官转移的患者BRAF基因突变多见，提示与患者肿瘤转移有关，预后不良。

关键词:BRAF基因；结直肠癌；病理；临床预后

各地资料显示随着人民生活水平提高，饮食结构改变，结直肠癌成为消化道常见的恶性肿瘤，我国CRC患者发病率以每年3.9%速度递增，已经占恶性肿瘤的第3位，患者确诊后5年存活率仅为55%左右[1]。很多研究证实了RAS-BRAF-MAPK细胞信号转导通路激活与恶性肿瘤的发病、进展和恶性程度密切相关。原癌基因BRAF蛋白作为一种基因编码的丝/苏氨酸特异性激酶，是该通路细胞内重要信号转导因子,使肠道凋亡诱导因子失活造成细胞过渡增殖，促进组织分化、血管生成和侵袭转移等导致恶性肿瘤的发生[2]。随着对CRC发病分子的生物学机制和基因突变的不断深入研究，靶向药物治疗有效降低了患者死亡率提高生存质量的同时，也出现了临床耐药[3]。大量临床证实KRAS、BRAF基因突变患者在抗EGFR靶向治疗中无效，预后生存差，只有BRAF基因野生型患者才能从抗EGFR单克隆抗体治疗中获益[4]。BRAF基因是否成为临床耐药和不良预后的预测性指标，与疗效及预后的关系尚有争议[5]，本文旨在探讨术后的结直肠腺癌组织中BRAF基因突变情况与临床病理的相关性，并分析其对临床治疗和预后的影响，以下为研究过程回顾。

1材料与方法

1.1材料

收集我院2014年1~12月经病理科诊断手术166例原发结直肠癌腺癌组织标本及其癌旁正常组织(距肿瘤边缘<5cm)61例作为对照组。年龄19～76岁，平均(49.9±10.1)岁。患者术前均未行放、化疗。

1.2实验方法

1.2.1组织DNA分子提取：DNA小量抽提试剂盒(纯化柱式)购自碧云天生物技术研究所[6]。对病例癌组织、癌旁正常组织石蜡标本切8μm厚10张水展后用膜片捞出，同时切取4μm厚一张，行HE染色显微镜下观察肿瘤细胞集中区域。采用激光共聚焦切割仪选取对应区域将切片上肿瘤组织归入0.5mLEP管中脱蜡醇化，加入细胞裂解液55℃水浴过夜，50μL蛋白酶K消化，沉淀洗盐，-20℃冰箱保存备用，取样本行浓度、纯度测定稀释后行PCR检测。

1.2.2PCR产物扩增纯化：由上海碧云天生物技术有限公司利用软件Premier5.0设计PCR引物序列如下：BRAF基因第15号外显子：上游引物5'-CTCTTCCATAATGCTTGCTCTGATAGG-3'下游引物5'-GTGAGAAAAATAGCCTCAATTCTTACC-3'扩增片段长度为318bp。PCR反应体系50μL，反应条件为：95℃预变性 5min；94℃ 变性30s；60℃退火 30s，72℃延伸 60s，共30个循环；最后72℃ 延伸10min；降至4℃结束反应。于美国BIO-RAD 580BR PCR仪器上进行基因扩增。用纯化试剂盒将PCR产物纯化。取5μLPCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙啶染色，紫外灯下检测观察，照相存盘。

1.2.3DNA分子直接测序：将检测有单一条带的样本送公司测序，测序结果经人工校对记录后用DNAMAN6.0软件对测序图谱分析，与基因库BRAF基因序列比较总结结果。

1.3统计学方法

采用SPSS19.0 统计软件进行数据分析，采用χ2检验，以P<0.05表示差异有统计学意义。

2结果

2.1癌组织中B-RAF基因突变率为(15/166)9.04%。癌旁正常肠组织无基因突变。15外显子上突变类型有6种：常见突变类型为BRAF-V600E(11/15)，有1例第014号标本是多位点串联突变。见表1。

表1　结直肠癌BRAF基因15外显子突变类型

2.2癌组织BRAF基因突变组织分级低12.09%(11/91)的患者较组织分级高5.33%(4/75)患者突变率高，两者差异有统计学意义(χ2=6.79，P<0.05)。有淋巴转移患者12.37% (13/97)突变率较无转移2.90%(2/69)患者突变率高，两者差异有统计学意义(χ2=5.85，P<0.05)。 见表2。

表2　癌组织中BRAF基因突变状态与临床病理相关性

2.349例有远处器官转移的患者BRAF基因突变率14.29%(7/49)比无转移的患者突变率6.84%(8/117)增高显著，因(χ2=2.74，P>0.05)无统计学意义。癌组织中患者性别(χ2=3.65，P>0.05)、年龄(χ2=3.58，P>0.05)、发病部位(χ2=2.82，P>0.05)、浸润深度(χ2=1.94，P>0.05)的BRAF基因突变率与生存无相关性。 见表2。

3讨论

本研究检测癌组织中BRAF基因突变率(15/166)9.04%，符合目前文献BRAF基因突变率约4%～13%[7]。15例BRAF基因突变患者中有93.33%(14/15)为第600个脱氧核苷酸突变， BRAF-V600E突变有11例为常见突变类型。癌组织分化程度低(χ2=6.79，P<0.05)、有淋巴转移患者BRAF基因突变率高(χ2=5.85，P<0.05)。由于大多数病人术后3～5年会有复发转移风险，肿瘤分化程度越低、有淋巴转移提示患者肿瘤恶性程度越高、分期都较晚复发转移风险大。早期检测KRAS、BRAF等基因突变情况指导临床用药[8]。结直肠癌患者术后的生存不排除受肿瘤的病理类型、分期和治疗手段、药物敏感程度、心态因素、经济条件、个体差异等诸多因素影响，实验证实BRAF基因突变患者药物治疗效果差，生存时间短[3]。远处转移患者中BRAF基因突变率14.29%(7/49)比无转移的患者突变率6.84%(8/117)增高显著，提示与肿瘤转移有关，由于有远处转移属于晚期患者即使进行原发灶和转移灶手术治疗，患者复发转移风险高治疗效果差预后不良[4]。差异无统计学意义(χ2=2.74,P>0.05)。目前研究认为肿瘤的发生由复杂的网络系统调控，所有信号通路之间存在相互交叉，破坏其中某一通路可使得信号转导从这个网络中其它的通路进行，阻断一个受体或者激酶就能阻断任何信息传导是不客观的。说明除了BRAF基因外NRAS、CRAF基因及P13K/AKT、RalGDS途径等也可以调控EGFR信号通路激活形成肿瘤。没有一种肿瘤只存在一个治疗靶点, 往往是多个位点同时起作用, 也是目前临床靶向治疗耐药的主要原因[3]。开发多靶点药物和细胞毒药物联合用药，随着患者生存时间延长，药物的毒副作用也明显，生存质量得不到提高，患者因不能耐受药物反应、经济负担沉重而放弃用药，是目前CRC死亡率居高不下的主要原因。因此随着BRAF基因临床耐药和不良预后的预测性指标相关研究不断深入发展[9]，如何阻断BRAF/MAPK信号通路对结直肠癌患者的治疗和预后的影响仍需进一步探讨。

综上所述, BRAF基因突变研究短短几年，目前的基因检测手段及分子靶向治疗药物费用昂贵，为了减轻患者经济负担，提高靶向治疗效果，希望本研究能促进结直肠癌患者在选择治疗方案前早期检测相关基因状态，同时做好药敏试验，为临床用药提供准确理论依据[10]，相信未来靶向药物更加合理地应用临床，肿瘤的个体化治疗真正由理想变为现实，造福于广大结直肠癌患者。

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The significance of BRAF genetic mutations with pathological and clinical prognosis in colorectal cancer patients

WUJie1,LIUFeng-xu2,LIXue-xin2,YAOHai-tao2

(1.The Second People’s Hospital, Mudanjiang 157013，China; 2. The Basic Medical School, Jiamusi University, Jiamusi 154007, China)

Abstract：Objective：To study the correlation about the expression of BRAF genetic mutations with clinical pathological in colorectal cancer patients; and to analyze its significance of clinical treatment and prognosis.Methods：166 samples of colorectal adenocarcinoma tissues and 61samples of normal tissues adjacent to carcinoma were selected from affiliated hospitals of Jiamusi University during 2014. The PCR-DNA direct sequencing method is used to detect the BRAF genetic mutations situation in intestinal tissues. Results：①Among colorectal cancer patients, there were 9.04%(15/166) BRAF genetic mutations rates. BRAFV600E is mutation type of Common . Normal intestinal tissue adjacent to carcinoma was no BRAF genetic mutations. ② The mutations rates of BRAF genetic in cancer tissues of tissues low differentiation are higher than that of high differentiation (P<0.05). The lymphatic metastasis mutations rates of BRAF genetic in cancer tissues were higher than no metastasis (P<0.05). ③ The mutations rates of BRAF genetic have no relationship with gender, age, primary cancer location，infiltration depth, clinical stage and distant metastasis(P>0.05). Conclusion：In colorectal cancer patients, the cancer tissues have BRAF genetic mutations, and normal intestinal tissue adjacent to carcinoma was no BRAF genetic mutations. The situation of BRAF genetic mutations in colorectal cancer has correlation relationship with cancerous tissues differentiation degree and lymph node metastases. The BRAF genetic mutationsin cancer tissues of distant metastasis are higher than those with no metastasis. There are some relationship the patients with tumor metastasis，with prompt poor prognosis.

Key words:BRAF genetic; colorectal cancer; pathological；clinical prognosis

(收稿日期：2015-05-14)

中图分类号：R735.3+5

文献标识码：B

文章编号：1008-0104(2016)01-0069-03

作者简介：伍洁(1973～)女，黑龙江牡丹江人，硕士，副主任医师。主要从事消化道肿瘤及内科治疗研究。通讯作者：姚海涛(1964～)男，黑龙江佳木斯人，硕士，教授，硕士研究生导师。E-mail:jmsdxyht1228@163.com。

注：柳风序为佳木斯大学在校本科生。