WWOX和Ang-2在乳腺癌生成与发展过程中的表达①

李义强,徐　墨

(佳木斯大学附属第一医院,黑龙江 佳木斯 154003)



WWOX和Ang-2在乳腺癌生成与发展过程中的表达①

李义强,徐墨

(佳木斯大学附属第一医院,黑龙江 佳木斯 154003)

摘要:目的：通过WWOX和Ang-2基因在乳腺癌生成与发展过程中相关蛋白含量以及表达,来进一步分析WWOX和Ang-2在女性乳腺癌生成与发展过程中的相关性。方法：选用免疫组化法进行试验，选取乳腺良性肿瘤中正常组织13例、原位癌12例、浸润癌45例(其中病理组织学I级16例、II级14例、III级15例)共70例。结果：(1)WWOX、Ang-2基因在正常乳腺组织、原位癌及浸润癌组织中的阳性表达率分别是76.92%(10/13)，66.67% (8/12)，40.00%(18/45)；53.85%(7/13)，58.33%(7/12)，75.56%(34/45)且每组两两比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。用统计学方法Spearman分析，二者在三种组织中表达呈负相关(rs=-0.336，P<0.05)。(2)WWOX、Ang-2蛋白在乳腺浸润癌组织病理分级I、II、III中的阳性表达率分别是62.50%(10/16)，35.71%(5/14)，20.00%(3/15)；56.25%(9/16)，78.57% (11/14)，93.33%(14/15)且每组两两比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。二者在乳腺浸润癌病理分级I、II、III级中呈负相关(rs=-0.369，P<0.05)。结论: 在乳腺癌生发过程中，WWOX、Ang-2二者共同参与乳腺癌的发生发展，过程中WWOX表达下降、而Ang-2升高，并且二者在病程中呈负相关作用。

关键词：乳腺癌；WWOX；Ang-2；临床分期

1材料与方法

1.1材料

选取2013-01~2014-05佳木斯大学附属第一医院肿瘤科住院并进行手术的女性患者，收集术中切除的乳腺标本，通过查阅病例中病理科给予的术中快速病理及术后免疫组化结果，选取乳腺良性肿瘤中正常组织13例、原位癌12例、浸润癌45例(其中病理组织学I级16例、II级14例、III级15例)共70例，年龄25～66岁。所有蜡块病理组织学类型结果均由病理科确诊证实。实验所用兔抗人WWOX、Ang-2多克隆抗体、DAB显色剂购于上海联硕生物有限公司。

1.2免疫组织化学法

〗通过病历号选取病理科存档的蜡块，并将已经第一次固定的标本进行二次固定切片后HE染色，然后柠檬酸抗原修复，滴加兔抗人WWOX、Ang-2多克隆抗体(1:200)，经室温孵育1h后过夜，后经PBS缓冲液冲洗3次，DAB显色1~10min后冲洗3次，复染、脱水、透明、固定。阳性对照：用已染呈阳性切片作阳性对照。阴性对照：用PBS片代替为阴性对照。〗

1.3染色判断

细胞核内出现黄色或棕褐色颗粒认为WWOX阳性表达、细胞浆内出现黄色或棕褐色颗粒认为Ang-2阳性表达。镜下观察阳性细胞比例，观察的所有切片均用双盲法观察计数。每张病理切片至少在高倍镜下(×200)观察不重复的视野10个，以每100细胞为1个视野计算其中阳性细胞数。根据阳性细胞所占百分比和染色强度分别计分，前者计分按0分为≤0%～10%，1分为10%～25%，2分为26%～50%，3分为为51%～75%，4分为75%～100%。后者计分无色为0分，淡黄色1分，黄色2分，黄褐色3分，两者相乘得分:(-)为0~3分，(+)为4~6分，()为7~9分，()为10~12分，其中“-”示为阴性表达，"+"以上，示为阳性表达。

1.4统计学方法

采用SPSS18.0统计学软件进行计算，免疫组化阳性率采用χ2进行检验验，病理分级采用Spearman分析比较，P<0.05差异具有统计学意义。

2.1结果

(1)WWOX、Ang-2基因在正常乳腺组织、原位癌及浸润癌组织中的阳性表达率分别是76.92%(10/13)，66.67% (8/12)，40.00%(18/45)；53.85%(7/13)，58.33%(7/12)，75.56%(34/45)且每组两两比较，差异均有统计学意义(P<0.05)(表1~2)。用统计学方法Spearman分析，二者在三种组织中表达呈负相关(rs=-0.336，P<0.05)，见表5。(2)WWOX、Ang-2蛋白在乳腺浸润癌组织病理分级I、II、III中的阳性表达率分别是62.50%(10/16)，35.71%(5/14)，20.00%(3/15)；56.25%(9/16)，78.57% (11/14)，93.33%(14/15)且每组两两比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表3~4。二者在乳腺浸润癌病理分级I、II、III级中呈负相关(rs=-0.369，P<0.05)，见表6。

表1　WWOX在正常、乳腺癌、原位癌组织中表达

注： χ2=9.525，P<0.05。

表2　Ang-2在正常、乳腺癌、原位癌组织中表达

注： χ2=7.087，P<0.05。

表3　浸润癌中WWOX表达水平

注： χ2=6.973，P<0.05。

表4　分析结果

注： χ2=7.664，P<0.05。

表5　WWOX与Ang-2在三种组织中相关性

(χ2=5，P<0.05)，(rs=-0.336，P<0.05)。

表6　WWOX与Ang-2在浸润癌中相关性

(χ2=7.53，P<0.05)，(rs=-0.486，P<0.05)

3讨论

目前根据相关文献中显示WWOX可与多种肿瘤的发生有一定关联，如在食管癌，胃癌，肺癌，乳腺癌，前列腺癌，卵巢癌等恶性肿瘤中都出现不同程度的WWOX基因外显子丢失、杂合性缺失及的表达降低等异常表达[6]。国内学者王晓、晁岚、秦晓冰、张敬川等人的研究显示乳腺患者癌组织中的WWOX表达水平明显降低。还有国外学者Keltouma、Hans、Guler、Nunez等都有相同研究[7]。Ang-2尤其在肿瘤组织中表达有所增强，Charnock-Jones研究表明其可存在于成年女性生殖系统，如：卵巢、子宫内膜等，Ang-2参与生理性血管修复、重建，诱导内皮细胞分裂、移位[8]。像其他实体肿瘤一样，乳腺癌的生长和转移也有Ang-2等因子的参与其表达与癌肿临床分期、血液淋巴道、血道等均有相关[9]。说明乳腺癌的生成与发展的过程中Ang-2的高表起重要作用。其高表达可以使乳腺组织的血管修复、重建等功能调节异常，使肿瘤细胞突破基底膜时得到血液供应几率增大，可能引起乳腺癌发病几率增高。本实验在乳腺正常、原位癌、浸润癌组织；浸润癌I级、II级、III级随着乳腺癌病程递进过程中，WWOX蛋白表达下降、而Ang-2升高，表明共同参与乳腺癌的发生发展，并且二者在乳腺癌病程发生发展过程中起负相关作用。希望通过本实验的数据与结果，为检测乳腺癌发生、发展、治疗等方面提供新的依据，为治疗提供新思路。

参考文献:

[1]Holash J,Wiegand S J,Yancopoulos GD.New model of tumor angiogenesis:dynamic balance between vessel regression and growth mediated by angiopoietins and VEGF[J]. Oncogene,1999,18(38):5356-5362

[2]Bednarek AK,Laflin KJ,Daniel RL,et al.WWOX a novel WW domain containing protein mapping to human chromosome 16q23.3-24.1,a region frequently affected in breast cancer[J]. Cancer Res,2000,60(8):2140-2145

[3]Bednark AK,Keck-Waggoner C L,Daniel R L,et al.WWOX,the FRA16Dgene,behaves a suppressor of tumor growth[J].Cancer Res,2001,61(22):8068-8073

[4]李义强,王瑞,王彩霞,等.乳腺癌浸润发生前后Ang-2的表达及其意义[J].黑龙江医药科学,2011,34(1):20-21

[5]Yu Q,Stamenkovic I.Angiopoietin-2 is implicated in the regulation of tumor angiogenesis[J].Am J Pothol,2001,158(2):563-570

[6]Chang NS,Doherty J,Ensign A,et al.WOX1 is essential for tumor necrosis factor,UV light, staurosporine,and p53-mediated cell death, and its tyrosine 33-phosphorylated form binds and stabilizes serine 462 phosphorylated p53[J].Biol Chem,2005,280(52):43

[7]Keltouma Driouch,Hans Prydz,Rossana Monese1,et al Alternative transcripts of the candidate tumor suppressor gene,WWOX are expressed at high levels in human breast tumors[J].Oncogene,2002,21:1832-1840

[8]DS.Soluble flt-1 and the Angiopoietins in the development and regulation of placental vasculature[J].Anat,2002,200(6):607-615

[9]李义强,赵春雨,李壮，等.乳腺癌微淋巴管生成与淋巴道转移的关系[J].黑龙江医药科学,2012,35(2):65-66

(收稿日期：2015-11-10)

中图分类号：R737.9

文献标识码：B

文章编号：1008-0104(2016)01-0072-02无论在国内外乳腺癌都是女性常见的恶性肿瘤之一，近年来其发病率逐年增高，据WHO(世界卫生组织)统计每年诊断为乳腺癌女性至少120万。本病是一种多因素疾病，随着人类对疾病诊断、治疗与预防手段的提高，乳腺癌的研究方向已逐渐开始涉及更高的基因水平。肿瘤细胞初期在摆脱组织液营养的供给后，血管的建立与养分供应在肿瘤的生成、生长及浸润过程中起着重要的作用[1]。WWOX (ww domain contaming oxidoreductase) 是由Bednarek与Ried等人用基因测序法分离并分析的方法鉴定出的含氧化还原酶ww结构域的新基因[2]目前WWOX基因的研究逐渐在肺癌、卵巢癌、胃癌、乳腺癌等恶性肿瘤中展开，并且文献结果显示在肿瘤组织中都有表达减弱趋势[3]。Ang-2(angiopoietin-2，血管生成素-2)是近年发现的调节血管生成的调控因素之一，也是与肿瘤新生作用密切的因子之一[4]，所以Ang-2及其家族近年越来越受到人们的关注，对其的研究正日益增多[5]。本实验通过免疫组化法检测正常乳腺组织、乳腺原位癌组织、乳腺浸润癌组织中WWOX和Ang-2相关的蛋白含表达,来进一步分析二者在女性乳腺癌生成与发展过程中的相关性，争取寻求新的治疗方向，为临床上治疗乳腺癌及预后提供相关的理论依据。

作者简介：李义强(1962~)男,黑龙江佳木斯人，硕士，主任医师，硕士研究生导师。通讯作者：徐墨(1982~)男，黑龙江佳木斯人，在读硕士研究生。E-mail:xumo1982@163.com。