联用普通PCR法与细菌培养法检测脑膜炎奈瑟氏菌的临床意义

孙 茹

（阜新市细河区疾病预防控制中心 辽宁 阜新 123000）

流行性脑膜炎又叫做流行性脑脊髓膜炎，简称流脑。此病是由脑膜炎奈瑟氏菌通过呼吸道传播引起的一种急性呼吸道传染病[1]。此病起病急骤，传播迅速，致死率较高，可严重威胁患者的生命安全。此病患者可出现低热、头痛、呕吐、皮肤淤斑等临床表现。患者若未得到及时有效的治疗，极有可能引发败血症性休克、脑实质损害等严重的并发症，进而导致其死亡。因此，对流行性脑膜炎患者进行准确的诊断对挽救其生命具有重要的意义。过去，临床上多单纯采用细菌培养法检测脑膜炎奈瑟氏菌，但效果一般[2]。我院选取了在我院进行体检的438例受检者，对其联用普通PCR 法与细菌培养法检测脑膜炎奈瑟氏菌，取得了很好的效果。现将研究结果报告如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料 本次研究的对象为2013年11月至2015年11月期间来我院进行体检的438例受检者。在这438例受检者中，有男性受检者221例，女性受检者217例。他们的年龄在12岁～58岁之间，平均年龄为（35.4±21.5）岁。

1.2 检测方法

1.2.1 使用细菌培养法进行检测 用无菌棉拭子擦拭受检者悬雍垂后的鼻咽部黏膜处的分泌物进行标本采集。采用前期预热的双抗巧克力琼脂血平板对采集到的标本进行接种，并在保温状态下送至检验室。检验人员将平板放置于含有5% CO2的培养箱中进行培养，将温度设置为37℃，培养时间为18～24小时。然后挑选出灰白色、半透明的、湿润的、直径为1～2 mm的菌落，对其进行纯培养，培养时间为18～24小时。完成培养后进行涂片染色处理，再进行镜检。在镜检中若发现革兰阴性双球菌，检验人员需要进一步对其进行分离鉴定。若进行氧化酶实验的结果呈阳性，需要继续进行糖发酵试验和血清凝集试验。

1.2.2 联用普通PCR法与细菌培养法进行检测 采集标本后，立刻将标本置于预热的双抗巧克力琼脂血平板中进行接种，并在保温状态下送至检验室。将平板放置于温度为37℃的含有5%CO2的培养箱中进行培养，培养时间为18～24小时。挑选出灰白色、半透明的、湿润的、直径为1～2 mm的菌落，对其进行纯培养，培养时间为18～24小时。然后，进行涂片染色处理，再进行镜检。对镜检中发现的革兰阴性双球菌进一步进行分离鉴定。对进行氧化酶实验的结果呈阳性者，进行糖发酵试验。采用水煮法提取脑膜炎奈瑟氏菌的DNA模板。操作方法是：从培养平板上取出一定量符合标准的菌株，使其悬浮在100～200 μL的纯水上，加热煮沸。持续20分钟后，进行离心处理。以1000 rpm（转/分钟）的速度离心5分钟，然后吸出上清液作为DNA模板。使用PCR仪对DNA模板进行PCR试验，PCR的反应体系为：10 μL2×PCR Pre-Mix、2μL上游引物、2μL下游引物、4μL纯水、2μL DNA模板，其反应体积为20 μL，其循环条件为：94℃变性5 min→94℃变性30 sec→55℃变性30 sec→72℃变性45 sec→返回第二步循环35个循环→72℃变性5 min。用1.0%的琼脂糖对PCR反应产物进行电泳，以对脑膜炎奈瑟氏菌进行分型。

1.3 统计学方法 我们采用SPSS14.0统计软件对本研究中的数据进行处理，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，采用t检验，计数资料用百分比（%）表示，采用X2检验。当P＜0.05时视为差异有统计学意义。

2 结果

用细菌培养法进行检测的结果显示，在438例受检者的标本中，共检出7株脑膜炎奈瑟氏菌，其中有3株B群，2株C群，1株X群，血清中出现1株不可分群的流脑菌株，其检出率为1.60%。联用普通PCR法与细菌培养法进行检测的结果显示，在438例受检者的标本中，共检出10株脑膜炎奈瑟氏菌，其中有5株B群，2株C群，2株X群，1株W135群，不存在不可分群现象，其检出率为2.28%。联用普通PCR法与细菌培养法检测脑膜炎奈瑟氏菌的检出率高于单纯使用细菌培养法进行检测的检出率，差异有统计学意义（P＜0.05）。

3 讨论

流行性脑膜炎起病急骤，传播迅速，此病患者若未得到及时有效的治疗，极有可能引发败血症性休克、脑实质损害等严重的并发症，进而威胁患者的生命安全。因此，对流行性脑膜炎患者进行准确的诊断对挽救其生命具有重要的意义。过去，临床上多单纯采用细菌培养法检测脑膜炎奈瑟氏菌。该检测方法效果一般，且患者若在治疗的过程中使用抗生素，可使患者的血培养结果呈阴性，此时细菌培养法无法有效地将菌株分离出来，从而会降低检出率[3,4]。近年来，随着微生物检测技术的飞速发展，PCR技术开始应用于多种病原微生物的检测中。且使用普通PCR法进行检测在2～4小时内就能得到检测结果，快速、有效[5]。本次研究的结果显示，单纯使用细菌培养法检测脑膜炎奈瑟氏菌的检出率为1.60%，联用普通 PCR 法与细菌培养法检测脑膜炎奈瑟氏菌的检出率为2.28%，这说明联用普通PCR 法与细菌培养法对脑膜炎奈瑟氏菌进行检测可以有效地提高该菌的检出率。单纯使用细菌培养法对脑膜炎奈瑟氏菌进行检测时检出3株B群、2株C群、1株X群，与联用普通 PCR 法和细菌培养法对脑膜炎奈瑟氏菌进行检测的分型结果完全相符。单纯使用细菌培养法对该菌进行检测时出现了1株不可分群的流脑菌株，联用普通 PCR 法与细菌培养法对该菌进行检测时分群出W135。这可能是因为这部分菌株存在群特异性基因，群特异性基因扩增使检测结果表现为阳性，但该基因中存在缺失、滑移错配及插入情况，使其荚膜不能正常表达，因此在血清中不能分群[6]。

综上所述，联用普通PCR法与细菌培养法检测脑膜炎奈瑟氏菌可有效地提高其检出率。此检测方法值得在临床上推广应用。

[1] 郭琍,黄志峰,任结梅.广东省近两年流行性脑膜炎奈瑟氏菌菌群分布及药敏性结果分析[J].今日药学,2011,21（12）:764-765.

[2] 朱宏飞.脑膜炎奈瑟氏菌荚膜抗原基因簇的研究和遗传分型方法的建立[D].南开大学，2012.

[3] 陈航,方瑾.脑膜炎奈瑟氏菌表面蛋白A的克隆表达及血清学分析[J].细胞与分子免疫学杂志,2013,29（04）:414-417.

[4] 吴苏宏,郭月丽,李曲文.脑膜炎奈瑟氏菌B群引起一例新生儿流脑的实验室诊断及流行病学调查[J].教育教学论坛,2013,05（46）:154-155.

[5] 郑鑫.脑膜炎奈瑟氏菌表面蛋白NspA基因的克隆与原核表达[D].长春理工大学,2011.

[6] 黄明明,邹玲,刘文华,等.水貂脑膜炎奈瑟氏菌感染的诊断及药敏试验[J].经济动物学报,2014,36（01）:41-43，46.