单核细胞增生李斯特氏菌国家标准检验方法的验证与探讨

□ 马 源 边芝慧 赵 苑 陕西省榆林市榆阳区食品检验检测中心

单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）是李斯特氏菌属中唯一具有致病性，也是致病力最强的细菌，是一种人畜共患的病原菌。它可以穿过宿主三个屏障，即肠屏障、血脑屏障和胎盘屏障，然其引起的疾病的发生率不高，但死亡率可达20%～30%[1]。单增李斯特氏菌易于在冷藏食品中存活，是对人类健康危害最大的一种。在4 ℃的储存条件下依然能够生存繁殖，主要存在于牛奶、乳制品、生牛排、羊肉、腌腊食品、西红柿、沙拉、水产品等中。在我国，食品中单增李斯特菌要求为不得检出。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料来源

本实验室提供的食品样品，编号YYSJ-2019-003。

1.1.2 主要仪器设备

生物安全柜（HR60-ⅡA2）、恒温恒湿培养箱（LHS-250SC）、全自动微生物生化鉴定仪（VITEK 2COMPACT）、医用冷藏箱（HYC-390）和正置生物显微镜（BX43）。

1.1.3 培养基与试剂

李斯特氏菌显色培养基、PALCAM琼脂、SIM动力培养基、血平板，北京陆桥技术有限公司；李氏增菌肉汤（LB1、LB2）、TSA-YE，广东环凯微生物科技有限公司；单增李斯特氏菌生化鉴定试剂盒（比色法），法国Bio Meriuex公司；标准菌株单核细胞增生李斯特氏菌（ATCC19115）、斯氏李斯特氏菌（ATCC35967）、伊氏李斯特氏菌（ATCC19118）、马红球菌（ATCC6939）、英诺克李斯特氏菌（ATCC33090），美国菌株保藏中心（ATCC）。试验中涉及的试剂和培养基均在有效期内并受质量控制。

1.2 方法

按国家标准检验检测方法GB4789.30-2010[2]。首先使用酒精灯对样品表面进行烧灼消毒，之后用无菌剪刀切割并取样25 g深层肌肉，然后加入225 mL LB1增菌液，30 ℃培养24 h。取0.1 mL，转种于10 mL LB2增菌液内，30 ℃培养24 h。在李斯特氏菌显色平板以及PALCAM平板上，通过接种环将LB2增菌液以划线方式接种，并于36 ℃环境中培养24～48 h；同时，接种单增李斯特氏菌、英诺克李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌、斯氏李斯特氏菌、马红球菌标准菌株[3]，分别作为阳性对照和阴性对照。从李斯特氏菌显色平板、PALCAM琼脂平板上取5个以上的可疑菌落，然后，将菌落接种于木糖、鼠李糖中，在36 ℃条件下培养24 h；并在TSA-YE培养基上纯培养后，再按照染色镜检、动力试验、生化鉴定、溶血试验和协同溶血试验的顺序进行操作。最后，使用李斯特氏菌属鉴定试剂盒和全自动微生物生化鉴定仪鉴定了TSA-YE上纯培养的菌株。

2 结果

2.1 选择性培养基的培养结果

5个PALCAM培养基平板上菌落略微凸起，灰绿色菌落，表面光滑、湿润、边缘整齐，形态一致，周围有棕黑色水解圈；而实验样品和单增李斯特氏菌在李斯特氏菌显色培养基上为蓝绿色菌落，圆形、光滑的表面，边缘整齐、周围有白色晕圈，伊氏李斯特氏菌菌落形态与之相似；斯氏李斯特氏菌和英诺克李斯特氏菌菌落形态与单增李斯特氏菌相似，只是菌落周围没有水解圈。

2.2 菌株生化特征

实验样品及四种李斯特氏菌标准菌株生化反应中，与葡萄糖、MR-VP、麦芽糖、七叶苷、甘露醇等具有相同的反应结果。另外，与木糖反应结果中，除伊氏李斯特氏菌的木糖反应为阳性，其他都为阴性。其中，通过溶血反应区分单增细胞李斯特氏菌和英诺克李斯特氏菌，并且通过协同溶血反应进一步证实英诺克李斯特氏菌的不溶血现象。使用木糖和鼠李糖发酵管反应，可以将单增李斯特氏菌和伊氏李斯特氏菌、斯式李斯特氏菌区分开，见表1。

2.3 生化鉴定结果

经由李斯特氏菌属生化鉴定板条的10种生化反应，鉴定实验样本和李斯特氏菌属，见表2。

2.4 VITEK 2COMPACT鉴定结果

通过全自动微生物生化鉴定仪检测得出，四种标准菌株以及实验样品均被鉴定为李斯特氏菌属，但无法鉴定李斯特氏菌种。

表1 实验样本及李斯特氏菌属标准对照菌株的生化特征

表2 李斯特氏菌属鉴定试剂盒鉴定结果

3 讨论

通过一系列验证单核细胞增生李斯特氏菌检验方法GB4789.30-2016，利用李斯特氏菌显色培养基进行选择性分离培养，可通过菌落形态进行初步区分，排除不必要的杂菌，再用木糖、鼠李糖发酵管等生化反应区分单增李斯特氏菌与伊氏李斯特氏菌。单增李斯特氏菌与其他李斯特氏菌种通过溶血试验和协同溶血试验来区分和确认。溶血试验中所使用血平板的厚度对试验结果有较大影响，若血平板过厚，如每皿琼脂量大于20 mL会使血平板于明亮处不能透视观察协同溶血反应；若血平板过薄，则穿刺易刺到底，直接影响溶血现象，溶血环不易确定；因此血平板的薄厚应以每皿15～20 mL琼脂量为宜。另外，可同时使用李斯特氏菌属鉴定试剂盒进行生化鉴定，通过API Listeria图谱结果区分单增李斯特氏菌、英诺克李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌和斯氏李斯特氏菌，进一步证实了选择性平板分离培养和生化鉴定结果的准确性。此方法省去了溶血试验和协同溶血试验的鉴定步骤，使检测效率提高的同时也提升了检测的准确度。