环洞庭湖地区活禽市场鸭源NDV的分离鉴定及遗传演化分析

2016-01-13胡仕凤王卫国何世成唐小明鲁杏华王昌建

动物医学进展 2015年11期

关键词：分离鉴定

郭　威，胡仕凤，王卫国，何世成，唐小明，林　源，鲁杏华，王昌建*

(1. 湖南农业大学动物医学院，湖南长沙 410128；2.湖南省动物疫病预防控制中心，湖南长沙 410019)

环洞庭湖地区活禽市场鸭源NDV的分离鉴定及遗传演化分析

郭威1，胡仕凤1，王卫国2，何世成2，唐小明2，林源2，鲁杏华2，王昌建2*

(1. 湖南农业大学动物医学院，湖南长沙 410128；2.湖南省动物疫病预防控制中心，湖南长沙 410019)

摘要：从洞庭湖地区周边县市几个活禽市场的健康家鸭中分离到14株具有血凝性的病毒，通过血凝、血凝抑制试验及RT-PCR鉴定，其中1株为新城疫病毒，命名为Duck/hunan/yy858/14。通过对该病毒的F基因全长扩增，并转化、克隆、测序及构建F基因的遗传进化树，推导其核苷酸序列。序列测定及遗传进化分析显示，该毒株F基因全长为1 792 bp，ORF为1 662 bp，可编码553个氨基酸，其氨基酸裂解位点的组成为112ERQERL117，具有典型新城疫病毒弱毒的分子特征，与我国内地首次分离到的Class I 毒株NDV08-004、吉林野鸟毒株J36/13、香港活禽市场分离株Chicken/HongKong/1525.16/2005在同一分支，属Class I类基因3型。同源性分析显示该毒株与ClassⅡ中弱毒疫苗株V4和La Sota的核苷酸及氨基酸的同源性均较低，分别为73.4%和71.6%；与香港活禽市场分离株Chicken/HongKong/1525.16/2005和首例内地分离到的鸭源新城疫病毒毒株Duck/China/08-004/2008的核苷酸同源性分别为91.2%、91.0%；与吉林野鸟毒株J36/13的核苷酸同源性最高为98.3%，推测与野鸟毒株有共同来源。

关键词：活禽市场；鸭源NDV；分离鉴定；遗传进化分析

新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)属副黏病毒科禽腮腺炎病毒属，仅有一个血清型，其宿主广泛，能导致鸡、火鸡、各种野生禽及观赏鸟类等250多种不同禽类的感染[1]，引发新城疫(Newcastle disease，ND)，该病毒强毒引起的是一种高度接触性的急性烈性传染病，对养禽业影响极大。NDV基因组长度存在15 186、15 192、15 198 bp 3种[2]，前两种均属于ClassⅡ类，第3种属于Class Ⅰ类。该基因组可编码6种结构蛋白，其中F基因编码的F蛋白(fusion protein)主要负责病毒囊膜和宿主细胞膜之间的融合[3]，是决定NDV毒力强弱的主要基因，也是NDV分子流行病学研究的首选基因。

Composing Principles of 630 Tibetan Veterinary Proved Recipes and

VeronicaciliataBased on Traditional Chinese Medicine Inheritance System

CHEN Chao-xi，HE Dong-mei，WEN Juan，TANG Cheng

(CollegeofLifeScienceandTechnology,SouthwestUniversityforNationalities,Chengdu,Sichuan,610041,China)

Abstract:To analyze the composing principles of the prescriptions of 630 Tibetan veterinary proved recipes and Veronica ciliata, unsupervised data mining method such as revised mutual information, complex system entropy cluster and unsupervised hierarchical clustering were used based on the traditional Chinese medicine inheritance system software．The results showed that the single medicine, classification, four properties, five tastes channel-tropism with a higher use frequency in 630 proved recipes were Terminalia chebula, Asteraceae, warm, bitter and liver individually; and two new prescriptions were mined from the 26 proved recipes including Veronica ciliata． A Newcastle disease virus，named duck/hunan/yy 858/14，was isolated from 14 samples of the healthy ducks in live poultry markets around Dongting Lake region. It was identified with hemagglutination test，hemagglutination inhibition test and RT-PCR. The virus F gene was amplified by RT-PCR, sequenced and analyzed by DNA Star and Lasergene software. The phylogenetic tree of F gene was constructed . The result showed that the total length of the F gene was 1 792 bp，ORF was 1 662 bp. The F gene encodes 553 amino acids. The virus named duck/hunan/yy 858/14 belong to genotype 3 of Class I virus. It′s composition of amino acid cleavage site was112ERQERL117，which was typical molecular characteristic of Newcastle disease virus. Homology analysis showed that the homology was low, 73.4% and 71.6% respectively among duck/hunan/yy 858/14, V4 and La Sota vaccine strains in ClassⅡ. The homology was high, 91.2% and 91.0% respectively among duck/hunan/yy 858/14, Chicken/HongKong/1525.16/2005 and Duck/China/08-004 /2008,there is closer genetic relationship to wild-bird Jilin strain J36/13.

Key words:Tibetan veterinary proved recipes; traditional Chinese medicine inheritance system; composition principle; Veronica ciliata duck NDV；live poultry market；isolation and identification；genetic evolution analysis

Class Ⅰ NDV广泛存在于野生水鸟、家禽及活禽市场，早期从家鸭中分离到较多。近年来，不断有报道称在美洲、欧洲及中国香港等地的活禽市场中可分离到不同基因的Class Ⅰ NDV[4-6]。水禽被认为是NDV的天然存储库，对NDV的长期地方性流行起重要作用，野禽、水禽和家禽之间很可能存在双向传播现象[7]。湖南洞庭湖地理位置和气候条件优越，生态系统完整，是我国候鸟迁徙的主要“中转站”，水禽的带毒污染同样对候鸟存在高风险，所以加强对水禽尤其是健康水禽携带NDV的病原学监测，了解活禽市场水禽源NDV毒株的分子生物学特性及在流行病学中的意义，为更好地防范新城疫的发生提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1试剂RNA提取试剂Trizol Reagent购自Invitrogen公司；dNTP、DNA Marker和Taq DNA聚合酶购自购自宝生物工程(大连)有限公司；质粒提取试剂盒和PCR产物回收纯化试剂盒购自Qiagen公司；克隆载体pGEM -T Easy Vector和反转录试剂盒AMV Reverse Transcriptase kit购自Promega公司。

1.1.2样品从湖南洞庭湖周边3个县市(岳阳市、常德市、益阳市)的几个活禽市场的临床健康家鸭体内，共采集泄殖腔棉拭子420份。

1.2方法

1.2.1引物设计与合成根据GenBank中发表的Class Ⅰ NDV-F基因核苷酸序列，设计合成特异性引物，预计扩增产物大小1 907 bp(表1)，由哈尔滨博仕生物有限公司合成。

表1　NDV-F基因扩增引物

1.2.2样品采集与处理采集的样品置于0.01 mol/L PBS中，加入青霉素(2 000 IU/mL)、链霉素(2 mg/mL)和林可霉素(50 mg/mL)，充分振荡混匀，置于4℃过夜后离心(12 000 r/min，2 min)，取上清备用。

1.2.3病毒的分离与鉴定取处理好的样品上清液尿囊腔接种9日龄～11日龄的SPF鸡胚，3个胚/份样品，0.2 mL/胚，37℃继续孵育。弃去24 h内死亡鸡胚，收集24 h～72 h死亡和未死亡鸡胚的尿囊液。采用病毒血凝试验(HA)检测病毒血凝性，血凝阳性的病毒液再分别用来自哈尔滨兽医研究所国家禽流感参考实验室提供的NDV标准阳性血清、禽流感病毒(AIV)的p、p、H9标准阳性血清和EDS76标准阳性血清进行病毒血凝抑制试验(HI)，以确定是否为NDV。然后采用鸡胚有限稀释法，用含有双抗的PBS将分离株尿囊液作10倍倍比稀释，取105～109稀释梯度接种9日龄～11日龄SPF鸡胚，每个稀释梯度接种2枚，100 μL/枚。置于37℃孵化室，分24、36、48 h时段照胚，弃掉24 h内死亡鸡胚，收集24 h以后的死胚和活胚，选取最高稀释度且血凝价合适的鸡胚尿囊液继续传代接种，如此连续3次纯化后进行RT-PCR的进一步鉴定。

1.2.4病毒RNA提取、cDNA的合成及F基因扩增取以上分离纯化毒株的鸡胚尿囊液200 μL，按试剂盒操作说明进行病毒RNA的提取和反转录，得其cDNA，然后进行PCR扩增，反应条件为：95℃ 5 min,94℃ 30 s,56℃ 45 s,72℃ 1 min,进行35个循环;然后72℃ 10 min,最后取6 μLPCR产物进行10 g/L琼脂糖凝胶电泳，鉴定结果。

1.2.5PCR产物的克隆转化和序列测定将PCR产物经胶回收纯化后,16℃ 3 h连接至pGEM-T Easy Vector；转化至DH10 Bac感受态细胞,均匀涂布于含氨苄青霉素的LB固体培养基,37℃培养过夜。挑取阳性菌落(白色单个菌落)进行PCR鉴定，反应条件为：95℃ 5 min,94℃ 30 s,56℃ 45 s,72℃ 1 min,进行35个循环;72℃ 10min。选取3个鉴定为阳性转化的重组菌落送哈尔滨兽医研究所流感病毒组进行测序。

1.2.6F基因的遗传进化树构建及同源性比较分析利用DNA Star软件对所测定的NDV Cuck/hunan/yy858/14的F基因序列与从GenBank中获取的23株已发表的Class I NDV和部分ClassⅡNDV基因进行序列分析和同源性比较，应用遗传进化分析软件MEGA 5.1，以Maximum likelihood方法构建NDV F基因的系统进化树。

2结果

2.1病毒的分离鉴定

接种鸡胚后获取的尿囊液，测得14份具有血凝性，然后将有血凝性的尿囊液(即病毒液)进行血凝抑制试验(HI)。结果显示有1份病毒液的血凝性能被NDV标准阳性血清抑制而不能被AIV各亚型阳性血清及EDS76标准阳性血清抑制；此外，观察鸡胚胚体有出血和充血情况，从而初步鉴定该分离株为新城疫病毒(NDV)。

2.2F基因的扩增

经10 g/L琼脂糖凝胶电泳,显示F基因的RT-PCR扩增产物片段大小约为2 000 bp，与预期目的片段(1 907 bp)大小相符(图1)，证实为NDV，命名为NDV duck/hunan/yy 858/14。

M.DNA标准 DL 2 000；1.病毒分离株

2.3F基因的序列和遗传进化分析

将测得NDV duck/hunan/yy 858/14的F基因序列与从GenBank中获取的23株已发表的Class Ⅰ NDV和部分ClassⅡ基因进行比对分析,采用MEGA5.1软件构建F基因遗传进化树(图2)。从图可以看出,本分离株NDV duck/hunan/yy 858/14与我国内地首次分离到的Class Ⅰ 毒株NDV08-004、吉林野鸟毒株J36/13、香港活禽市场分离株Chicken/HongKong/1525.16/2005同属于Class Ⅰ基因3型；与弱毒疫苗株V4、La Sota等属不同分支，遗传进化关系较远。序列结果表明分离株NDV Duck/hunan/yy 858/14的F基因全长为1 792 bp，ORF为1 662 bp，共编码553个氨基酸。裂解位点的氨基酸组成为112ERQERL117，符合典型的新城疫病毒弱毒株特征，但不同于弱毒疫苗株La Sota F蛋白裂解位点的氨基酸序列112GRQGRL117。本分离株 F蛋白的第25位氨基酸为M(蛋氨酸)，

图2　NDV F基因遗传进化树

与王伟伟等[8]研究总结的ClassI NDV的典型分子特征结果一致。通过对分离株的F基因蛋白的潜在糖基化位点(Asn-X-Ser/Thr结构,NXS /T)分析比较发现：分离株6个糖基化位点分别位于第85-87(N-R-T)、191-193(N-K-T)、366-368(N-T-S)、447-449(N-I-S)、471-473(N-N-S)、541-543(N-N-T)位氨基酸，均高度保守。

核苷酸同源性分析显示：与香港活禽市场分离到的同为Class Ⅰ基因3型毒株Chicken/HongKong/1525.16/2005的同源性为91.2%；与刘华雷首次在内地分离到的Class Ⅰ类毒株Duck/China/08-004/2008的核苷酸同源性为91.0%；与吉林野鸟毒株J36/13的核苷酸同源性为98.3%；与ClassⅡ类的弱毒疫苗株V4、La Sota的核苷酸同源性分别为73.4%和71.6%。

3讨论

研究表明，新城疫病毒在其演变过程中产生了两大分支，即ClassⅠ和ClassⅡ。Ⅰ类新城疫病毒可分为9个基因型,分别为基因1～9型；Ⅱ类新城疫病毒也可分为9个基因型,分别为基因型Ⅰ～Ⅸ型，其中基因Ⅳ型是造成新城疫第一次世界大流行的主要基因型，危害对象主要是鸡，水禽和鸟类几乎不发病；基因V型是造成第2次大流行的主要基因型，始于中东的鹦鹉国际贸易，危害对象主要是观赏鸟及禽类；由鸽子引起的第3次大流行的主要基因型是Ⅵ型；基因Ⅶ型则是造成20世纪90年代以来在亚洲、欧洲和非洲等地区引起第4次大流行的基因型，此次的流行开始对水禽的危害增大，且基因Ⅶ型的毒株已初步演变为a、b、c、d、e、f等若干亚型[9]。Class I NDV大多从野生水禽及家养水禽中分离，被认为是一种广泛存在于水禽体内且不致病的NDV[10-11]，近年来就有报道美国、香港以及我国内地从活禽市场中分离到ClassⅠNDV, 且这些病毒与当地所使用的疫苗株不同。本分离株NDV Duck/hunan/yy858/14与香港活禽市场分离株Chicken/HongKong/1525.16/2005、刘华雷首次在内地分离到的NDV毒株Duck/China/08-004/2008同为ClassⅠ基因3型，且它们之间的同源性都在90%以上，但已出现在了不同的小分支上，说明随着时间的推移，已存在一定程度的变异；又因为与广泛使用的NDV弱毒疫苗株LaSota遗传距离较远,说明分离株不是来自疫苗的散毒；与吉林野鸟毒株J36/13的亲缘关系更近，核苷酸同源性为98%以上，推测两者有共同的毒株来源。

我国目前的活禽市场监测到的多数为健康禽类带弱毒，有试验表明，Class Ⅰ NDV的高感染或带毒，虽然一定程度上有利于提高禽群对新城疫的免疫保护，但却加大了新城疫病毒毒株间相互影响和作用，增加了病毒变异的几率[12-13]。曾有报道这种Ⅰ类新城疫病毒一旦通过水禽传播到易感的陆生家禽如鸡中,则毒力发生返强的可能大大增加[14]，目前就存在有1例实验室返强毒株[15]，证实了Class Ⅰ弱毒株返强的可能性。

以前，人们更加关注致病性毒株的研究而忽视了对低致病性毒株的检测及毒力演变等相关性的研究，导致这种弱毒株在家禽-水禽-野禽中的循环，从而存在演变成强毒株的危险。活禽市场是一个人为的小生态环境，其中有家禽、水禽、各种鸟类以及被捕捉的野禽交易，环境的恶劣程度加强，迎合了新城疫病毒变异速度快的特征，加快了新城疫病毒的进化，加大了产生新基因型的可能，所以从活禽市场来探究新城疫病毒的溯源、流行和进化，对于新城疫病毒的未来研究及防制措施的制定具有重要意义。

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Isolation,Identification and Genetic Evolution Analysis of Duck NDV